一种血浆中游离的目标dna低频突变富集测序方法_5

LD PCR。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)文库的Tm值通过以下方法来确 定，对正常人血浆中游离的目标DNA连接文库采用1对引物使用荧光定量PCR，根据溶解曲 线分析获得文库Tm值；所述1对引物的核苷酸序列为： 上游引物： AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT， 下游引物： CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，其中 XXXXXXXX 为index标签。5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)所述的1对通用引物为通用文库 TT-COLD PCR引物，其核苷酸序列为： 上游引物： AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT， 下游引物： CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，其中 XXXXXXXX 为index标签D6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述1个系列循环条件为：7. 根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，步骤（3)所述探针富集捕获是将扩 增后的文库质控合格后，采用富集探针芯片进行杂交捕获，并对杂交捕获产物进行PCR扩 增，然后进行上机测序； 富集探针芯片的设计方法为：基于目的基因的用途确定芯片捕获区间，参考目标DNA 所属的数据库，在一定碱基范围内，确定至少1个最重要的热点变异位点，同时针对该位点 存在的多种突变类型，以几种主要类型作为参考，基于相应的发生频率作为其在该位点总 探针覆盖水平所占的比例；针对热点变异，将基于人基因组参考序列hgl9设计的探针替换 为基于突变碱基设计的探针，其他位点探针不变，同时热点变异探针总覆盖度与其他区域 正常探针覆盖度的差异比例不少于3 :1，从而实现捕获时对热点变异的富集。8. 根据权利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，步骤（4)正反双链纠错低频信息分 析，具体方法为： 1) 基于测序结果，截取成对测序序列中的测序序列1的如12bp喊基和测序序列2的如 12bp碱基作为标签，且根据字母序排列以较小的标签在前连接成24bp的一条索引，同时根 据标签的排列组合方式，选定正链和反链； 2) 对索引进行外部排序，以达到将同一个DNA模板的所有测序序列聚集到一起的目 的； 3) 对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据其序列之间的汉明距 离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的汉 明距离不超过10,以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的； 4) 对步骤3)中获得的同一个DNA模板的重复簇进行筛选，若正链和反链的测序序列数 都达到2对以上，则进行后续分析； 5) 对满足4)中条件的簇进行纠错，并产生一对无错的新测序序列.对于DNA模板的每 一个测序碱基，若某种碱基型在正链的测序序列中的一致率达到80 %，且在反链测序序列 中的一致率也达到80 %，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否则记为N，这样便得到 了代表原始DNA模板序列的新测序序列； 6) 将新测序序列用bwa mem算法重新比对到基因组上，筛除比对质量小于30的测序序 列； 7) 根据6)中得到的测序序列进行统计，得到捕获区域内每个位点的碱基型分布，统计 目标区域覆盖大小、平均测序深度，正反链互配率，低频突变率； 8. Call SNV/InDel/SV/CNV :根据患者样品与对照样品信息的比对，用mutect流程 call somatic SNV 变异；用 gatk 流程 call somatic InDel 变异；用 contra, py 流程 call CNV ;用 somVar 流程 call SV ; 所使用的筛选参数为：对照位点变异率< 2% ;纠错后变异测序序列条数多2 ;突变预 测P值彡〇. 05 ; 9) 变异注释：注释变异的功能、变异测序序列支持数、变异频率、氨基酸变异及已有变 异数据库中的该变异的情况。9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤1)中，基于插入片段两端的序列碱 基作为标签，经双末端测序，每个片段将形成一对成对测序序列；将成对测序序列的测序序 列1的如12bp喊基和测序序列2的如12bp喊基作为标签，字母序排列以车父小的标签在如 连接成24bp的一条索引，并且以这24bp作为成对测序序列的索引，测序序列1的标签在前 就标记成正链；测序序列2的标签在前就标记为反链。10. -种血浆中游离的目标DNA低频突变富集测序试剂盒，其特征在于，含有富集探针 芯片，芯片上探针是将基于人基因组参考序列hgl9设计的探针替换为基于突变碱基设计 的探针，其他位点探针不变，且热点变异探针总覆盖度与其他区域正常探针覆盖度的差异 至少为3:1 ; 基于目标DNA突变碱基设计探针的方法为：根据目的基因的用途确定芯片捕获区间， 参考目标DNA所属的数据库，在一定碱基范围内，确定至少1个最重要的热点变异位点，同 时针对该位点存在的多种突变类型，以几种主要类型作为参考，基于相应的发生频率作为 其在该位点总探针覆盖水平所占的比例。11. 一种血浆中CtDNA低频突变富集测序的系统，包括： (1) 血浆中CtDNA文库构建单元； (2) 通用文库TT-COLD PCR扩增富集单元； (3) 探针富集捕获单元、杂交捕获产物的扩增与上机测序单元； (4) 正反双链纠错低频信息分析单元。12. 如权利要求11所述的系统，其特征在于，单元（2)的通用文库TT-COLD PCR扩增富 集单元是基于通用引物对所有类型变异实现第一级突变富集扩增；所述通用引物的核苷酸 序列为： 上游引物： AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT， 下游引物： CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATxxxxxxxxGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT，其中 XXXXXXXX 为index标签。13. 如权利要求11所述的系统，其特征在于，单元（3)的探针富集捕获单元是针对热点 变异通过富集探针芯片实现第二次富集捕获，所述富集探针芯片上探针是将原先基于人基 因组参考序列hgl9设计的探针替换为基于突变碱基设计的探针，其他位点探针不变，且热 点变异探针总覆盖度与其他区域正常探针覆盖度的差异至少为3:1 ; 基于CtDNA突变碱基设计探针的原则为：基于TCGA、ICGC、COSMIC数据库确定芯片捕 获区间，参考TCGA、ICGC、COSMIC数据库，在每200bp碱基范围内，确定至少1个最重要的热 点变异位点，同时针对该位点存在的多种突变类型，以几种主要类型作为参考，基于相应的 发生频率作为其在该位点总探针覆盖水平所占的比例。14. 如权利要求11-13任一所述的系统，其特征在于，单元（4)的正反双链纠错低频信 息分析单元是： 1) 基于插入片段两端的序列碱基作为标签，所述插入片段是文库中与接头引物相连接 的DNA片段，经双末端测序，每个片段将形成一对成对测序序列；将成对测序序列的测序序 列1的如12bp喊基和测序序列2的如12bp喊基作为标签，字母序排列以车父小的标签在如 连接成24bp的一条索引，并且以这24bp作为成对测序序列的索引，测序序列1的标签在前 就标记成正链；测序序列2的标签在前就标记为反链； 2) 对索引进行外部排序，以达到将同一个DNA模板的所有测序序列聚集到一起的目 的； 3) 对聚集起来的拥有相同索引的测序序列进行中心聚类，根据其序列之间的汉明距 离，将每个有相同索引的大簇聚集成若干个小簇，每个小簇中任意两对成对测序序列的汉 明距离不超过10,以达到区分开拥有相同索引却来自不同DNA模板的测序序列的目的； 4) 对步骤3)中获得的同一个DNA模板的重复簇进行筛选，若正链和反链的测序序列数 都达到2对以上，则进行后续分析； 5) 对满足4)中条件的簇进行纠错，并产生一对无错的新测序序列.对于DNA模板的每 一个测序碱基，若某种碱基型在正链的测序序列中的一致率达到80%，且在反链测序序列 中的一致率也达到80 %，则记新测序序列的这个碱基为此碱基型，否则记为N，这样便得到 了代表原始DNA模板序列的新测序序列； 6) 将新测序序列用bwa mem算法重新比对到基因组上，筛除比对质量小于30的测序序 列； 7) 根据6)中得到的测序序列进行统计，得到捕获区域内每个位点的碱基型分布，统计 目标区域覆盖大小、平均测序深度，正反链互配率，低频突变率； 8. Call SNV/InDel/SV/CNV :根据患者样品与对照样品信息的比对，用mutect流程 call somatic SNV 变异；用 gatk 流程 call somatic InDel 变异；用 contra, py 流程 call CNV ;用 somVar 流程 call SV ; 所使用的筛选参数为：对照位点变异率< 2% ;纠错后变异测序序列条数多2 ;突变预 测P值彡〇. 05 ; 9)变异注释：注释变异的功能、变异测序序列支持数、变异频率、氨基酸变异及已有变 异数据库中的该变异的情况。15. 权利要求1-9任一所述的方法或权利要求11-14任一所述的系统在制备疾病早期 筛查试剂盒中的应用。16. 如权利要求15所述的应用，其特征在于，所述的疾病为肿瘤。17. 权利要求1-9任一所述的方法或权利要求11-14任一所述的系统在制备疾病术后 监控试剂盒中的应用。18. 权利要求1-9任一所述的方法或权利要求11-14任一所述的系统在制备疾病用药 指导试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种血浆中游离的目标DNA低频突变富集测序方法，包括血浆DNA提取与文库构建、通用文库TT？COLD？PCR扩增富集、探针富集捕获、捕获产物PCR及上机测序、正反双链纠错低频信息分析，具体为基于通用引物进行TT？COLD？PCR对所有类型变异实现第一级突变富集扩增；设计富集探针芯片，针对热点变异将人基因组参考序列hg19设计的探针替换为基于突变碱基设计的探针，其他位点探针不变，进行第二级富集捕获；基于文库构建中的插入DNA两端12bp自身序列作为标签进行正反双链纠错比对，提高数据利用率，实现低频精确检测。本发明方法操作简便，实用性强，可以对0.01％低频变异具有高特异性检测。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105063208
【申请号】CN201510487759
【发明人】吕小星, 易鑫, 赵美茹, 管彦芳, 刘涛, 杨玲
【申请人】北京吉因加科技有限公司
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2015年8月10日