一种基于弹回探针引物技术的低频突变检测方法
【专利摘要】本发明属于基因检测【技术领域】，具体为一种基于弹回探针引物技术的低频突变检测方法。本发明包括：设计弹回探针引物、制备DNA模板、配置检测体系、设置反应程序和确定Ts值、结果的判定等步骤。本发明是将弹回探针引物富集扩增技术与弹回探针引物高分辨率溶解曲线相结合的低频突变检测技术，实现了万分之一甚至更高的检测灵敏度，并满足了临床上对突变检测技术不易污染，灵敏性高,特异性强,简便易行，结果判定的要求，可用于各类组织，包括新鲜组织样本，全血，血清，组织切片等样本的基因筛查，基因分型(SNP，缺失突变，插入突变)等方面。
【专利说明】一种基于弹回探针引物技术的低频突变检测方法
【技术领域】
[0001]本发明属于基因检测【技术领域】，具体涉及一种低频突变检测方法。
【背景技术】
[0002]随着临床上越来越多的运用到基因检测技术，基因检测，尤其是基因分型技术得到较快的发展，为遗传病的诊断，肿瘤标志基因的的检测，肿瘤病人的个性化用药提供了可行的检测方案。在肿瘤相关基因检测的过程中发现，由于肿瘤组织存在的异质性，取样位置的不确定性等，使得肿瘤组织检测技术的灵敏度要求较高。
[0003]另外，众多的研究发现，循环DNA与组织DNA突变具有一致性，这就表明检测肿瘤病人的外周游离的DNA能够反应肿瘤组织的突变状况，使得外周游离样本成为突变检测可替代的样本，由于循环外周血留取方便，可随时进行动态检测，因此成为较佳的替代选择。但是在循环血中除了肿瘤DNA，也存在正常组织DNA，且因个体差异，肿瘤发生发展时期，治疗时期等原因，循环DNA的总量不定，且肿瘤DNA所占比例很低，通常小于10%，这就要求突变检测的技术手段不需要依赖DNA浓度的判断，无需聚类对比，具备高特异性以及超高的检测灵敏度。
[0004]实现对低频突变的检测，需要结合富集扩增技术和高灵敏的检测技术。常见的富集扩增的技术包括酶切富集扩增，COLD-PCR，ARMS,锁核酸/肽核酸探针富集扩增技术(PNA/LNA probe ARMS), Scorpion-ARMS等，这些技术都能在原有的检测技术之上提高检测灵敏度几倍到几百倍，但是或多或少存在使用上的局限。
[0005]酶切富集扩增依赖酶切位点的存在，有`许多的位点无法使用此技术富集，且有的限制酶较贵，限制了此技术的使用，需要开盖分步操作，较为繁琐，对于大规模的样本检测工作量大。COLD-PCR是较为价廉，方便的一种富集扩增技术，根据突变与野生型模板之间存在微小的解链温度的不同，在扩增时选择突变模板解链温度作为变性温度(Tc值)，从而使得突变模板得到富集扩增，但是COLD-PCR技术要求突变的模板比野生型模板解链温度低，另外突变与野生型模板解链温度相差很小，使得实验前期Tc值较难摸索。且Tc值会因为实验体系改变，所用的仪器的改变，甚至是操作人员的改变而改变，因此不利于其推广利用。ARMS以及锁核酸/肽核酸探针富集扩增技术(PNA/LNA probe ARMS), Scorpion-ARMS为等位基因特异性扩增技术及其延伸扩展技术，运用这些技术已经解决了一系列的低频突变检测难题，并开发出相应的试剂盒对外出售。但是ARMS技术需要聚类对比，对原始扩增的基因组模板DNA浓度，新鲜度均一化要求较高，就EGFR/KRAS基因突变检测来说，基于Scorpion-ARMS技术的试剂盒一ADx_ Kras kit是目前公认用来进行EGFR/KRAS基因突变最敏感的方法，对突变检测的灵敏度可达1%，但此试剂盒对于不同的突变检测需要设计特异性探针。其结果受PCR仪的稳定性、基因突变结果判断的标准以及荧光曲线的判读等影响较大，技术通过聚类比较，判读CT值，所以对原始的模板浓度需要均一化，而血清、血浆样本的特点使得此方法运用到血浆血清样本检测成为障碍。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种成本低、操作方便、易于推广的低频突变检测方法。
[0007]本发明提供的低频突变检测方法，基于弹回探针引物技术，是将弹回探针引物富集扩增技术(Snapback ARMS)与弹回探针引物高分辨率溶解曲线(Snapback primer HRM)相结合的低频突变检测技术，实现了万分之一甚至更高的检测灵敏度，并满足了临床上对突变检测技术不易污染，灵敏性高，特异性强，简便易行，结果判定的要求，可用于各类组织，包括新鲜组织样本，全血，血清，组织切片等样本的基因筛查，基因分型(SNP，缺失突变，插入突变)等方面，以及实现对低频体细胞突变的检测。
[0008]本发明提供的基于弹回探针引物技术的低频突变检测方法，具体步骤为:
步骤1，设计弹回探针引物。
[0009]弹回探针引物(snapback primer)是将探针序列添加在一条扩增引物序列5'端后形成的集探针和引物双重作用的核酸序列，在PCR扩增时，发挥引物5’ -3’延伸的作用；不对称PCR扩增后，形成产物单链结构，探针序列可以弹回与目标杂交序列结合，形成二级结构，如图1所示；
(1)设计弹回探针引物序列时，先设计包含有待检测突变位点的特异性扩增引物，产物大小不超过300bp ；
(2)将覆盖突变位点的探针序列添加在相应一条扩增引物5'端，使得扩增之后形成的产物单条链，形成弹回蝎型结构，如图1所示； 注意:使突变位点处于探针 序列中间三个碱基的位置上；选择与野生型相匹配的探针；为防止弹回结构为3'端时，弹回探针引物中的探针部分会作为引物延伸，需要在弹回探针引物探针末尾添加两个不互补配对碱基；
(3)本发明采用不对称扩增的方式，上游高浓度引物为弹回探针引物，下游低浓度引物，称为限制引物，即为另一条未连探针的普通扩增引物；
(4)弹回探针引物和限制引物使用浓度比为10:1-20:1；
(5)在设计引物时，由于限制引物使用浓度偏低，实际体系中退火温度要比设计的温度要低，因此在设计时，限制引物Tm值要比弹回探针引物Tm值高3°C -5°C ；
(6)将扩增后形成的弹回结构碱基序列输入网页”The mfold web serve” 一 “DNA folding form”碱基序列输入框中，在阳离子浓度为50mM,Mg2+浓度为3mM,折叠温度为
55°C的条件下，确保扩增片段形成弹回蝎型结构，即示意图1中的结构，且二级结构形式单
o
[0010]步骤2，制备DNA模板。
[0011]使用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen , Germany), QIAamp blood DNA Midi Kit(Qiagen , Germany),细菌基因组DNA提取试剂盒(如天根生化科技(北京)有限公司)分别抽提组织DNA，血浆DNA，细菌基因组DNA ；
(1)组织DNA和细菌基因组DNA的抽提按照试剂盒说明执行；
(2)血浆DNA抽提之前在样本中加入100-200ng细菌基因组DNA，之后按照试剂盒的说明进行抽提。
[0012]步骤3，配置检测体系
使用定量384孔板进行实验体系的配置，检测体系中包含:弹回探针引物和限制引物，两者浓度比为 10:1-20:1 ;还包括:1XPCR buffer, IxLC Green plus+ +,0.4 U TaKaRaTaq HS，DNA 模板，ddH20。
[0013] 具体体系配置见实施实例。
[0014]步骤4，设置反应程序，确定Ts值(Light Cycler 480 II )
使用Roche荧光定量PCR仪(Light Cycler 480 II )进行反应程序的设置。包括普通PCR扩增设置，富集扩增的设置，HRM检测程序的设置。
[0015]富集扩增技术与普通PCR技术不同的是在于延伸温度上的选择，富集扩增技术选择的延伸温度为低于野生型扩增产物单链弹回结构解链温度而高于突变型扩增产物单链弹回结构的解链温度。
[0016]具体程序设计见具体实施实例。
[0017]步骤5，结果的判定。
[0018]Snager测序图以及HRM结果分析判断，LC480自带分析软件“Tm calling”分析。不同的突变区别对待。
[0019]本发明技术原理分析:
(I)高分辨率溶解曲线分析技术(high resolution melting analysis, HRM)利用不同长度或不同碱基组成的DNA序列溶解曲线不同的原理，在PCR后直接运行高分辨溶解就可完成对样品突变分析。通过大样本的HRM分析证实HRM是一种灵敏度为100%的EGFR基因突变筛选技术，可用于体细胞突变的检测和测序前突变的筛选。
[0020](2)传统的HRM通过扩增一段包含待检测SNP位点的IOObp左右的产物。通过检测产物的溶解温度的变化判断有无突变。该方法无需序列特异性探针，也不受突变碱基位点与类型的局限，应用Roche Light Cycler 480，等高分辨率的荧光定量PCR仪器分析，即可完成对样品基因型的判断，操作简单，无需PCR后续操作，选择性好。但该方法也有其局限性:只能分析纯度单一的小片段DNA，产物超过300bp，灵敏度下降，点突变产生的Tm的变化往往小于1°C，有时只有0.10C -0.2°C。这就在判别上产生难度，对实验均一化要求较高，实际操作工作中只能达到10%的突变检出率，反应受到体系中离子浓度影响，即反应条件以不相同就会出现差异，这就要求前期模板的均一化处理，且需要聚类比较，结果判断需要经验分析。
[0021](3)同时，并不是所有的SNP位点都能通过此法监测分析，据统计研究，条件优化的情况下，仍然有4%左右的SNP位点，以及一些纯和的大片段缺失无法通过其检测分析，总使得此技术的推广受到局限。
[0022](4)但是HRM技术作为一种闭管检测，简便快速，灵敏度高，重复性好，准确性高，可实现高通量检测的一种分型筛查方式，在临床推广上有着无可比拟的优越性。本发明旨在运用更高精度的HRM技术，增加其灵敏度，降低判别难度，拓宽检测范围，降低技术门槛，使其在临床运用上得到更好的运用。
[0023](5) HRM技术的检测原理依据在于碱基改变产生的Tm的变化，突变碱基在检测产物中所占比例越小，那么突变产生的碱基改变就会越大。有研究者就使用小片段扩增(small amplication (50bp)左右的产物进行HRM分析,实验可以解决SNP检测的盲区,突变产生的Tm的变化明显，相较而言判别容易，但是小片段扩增产物溶解曲线易于与引物二聚体相混判，长度上又有要求所以在引物的设计上要求高，难设计，检测受到局限。[0024](6)随后Zhou等发明了 Unlabeled primer HRM的HRM法，使得此技术得到较高程度上的提升，其原理为:合成一段封闭探针，与待检测位点杂交，形成双链杂交峰，通过杂交探针峰Tm值的变化判断突变有无。
[0025](7)实验关键在于:为实现闭管一步，实验要求使用不对称PCR产生与探针杂交的单链，使用的探针需要对3'端进行封闭，阻止在PCR过程的延伸。实验要求使用不对称PCR产生与探针杂交的单链。Unlabeled primer HRM可以检测几乎所有的SNP位点，缺失突变。点突变产生的Tm值的变化在2-8 V。
[0026](8)此方法得到的实验结果已经很大程度上满足低频稀少突变的检测。但是需要对探针封闭，使得实验受到封闭效率，方式上的限制，且费用增加。
[0027](9)弹回探针HRM技术:本发明在Unlabeled primer HRM技术基础上，使用弹回探针(snapback primer)HRM技术,其原理是,将杂交探针设计在一条扩增引物的5'端,通过不对称扩增后，探针弹回与目标片段杂交，形成分子内杂交的茎环二级结构，最后通过杂交区段的溶解曲线分析实现突变检测，由于弹回为5'端，所以不需要任何封闭修饰，为防止扩增中互补链弹回后进行3'的扩增，在弹回探针引物5'端需要设计2个不匹配碱基。实验证明，点突变产生的Tm的变化在2V _8°C。与unlabeled primer HRM检测灵敏度相等。甚至是更高，且不需要额外增加封闭费用。真正实现了低廉、闭管、简便、快速检测。
[0028](10)弹回探针HRM显示野生型与突变型之间的差异在5°C左右，因此在扩增循环过程中，将扩增延伸温度设置在探针与野生型模板结合的温度和与突变型模板结合的温度之间，将此扩增延伸温度称之为Ts值。如图2:突变型的样本模板在扩增时，单链弹回二级结构能够打开，游离的探针也无法结合在模板上，因此可以较为顺畅的进行扩增。而野生型由于能完全匹配，结合温度高于突变型5°C，因此在扩增时有弹回阻滞，一些游离的snapback primer探针部分也会结合在模板探针结合位点上造成探针对野生型模板扩增的阻滞。
[0029]本发明的优势
(I)使用弹回探针富集扩增技术，使得突变样本得到很好的富集扩增，灵敏度大大提高，与传统的富集扩增技术相比，弹回阻滞技术操作便捷，简单，无任何成本的增加，相比COLD-PCR中Tc值选择的难度，Ts值更易摸索，且对仪器，操作严苛程度上大大下降，便于推广实行，可实现技术的试剂盒商品化。
[0030](2)本发明利用弹回探针实现富集扩增以及HRM检测，在传统HRM技术之上毫无成本的增加，实现超高灵敏度，高特异，方便，快速，一步进行的高通量检测。
[0031](3)本发明在判读方式上仅仅依靠峰型的判断，无需特殊的分析软件，更无需聚类分析比较，可实现不同浓度样本的检测，这就意味着对样本均一化处理要求不高，降低了技术的操作门槛，可实现浓度差异很大，不同处理方式样本的分型比较。
[0032](4)本发明技术实现了在外周循环血样本中进行体细胞突变的检测。
【专利附图】
【附图说明】
[0033]图1:产物弹回结构图示。
[0034]图2;弹回探针富集PCR原理图。
[0035]图3:弹回探针 HRM 技术(EGFR EXONl9 del，LC480 II)图示。[0036]图4:弹回探针富集扩增HRM技术(EGFR EX0N19 del，LC480 II)图示。
[0037]图5:EGFR-exon 19 del (15bp)，经过弹回探针富集扩增(右图)的混合比例突变样本测序对比。
[0038]图6:弹回探针 HRM 技术(EGFR，L858R，LC480 II)图示。
[0039]图7:弹回探针富集扩增HRM技术(EGFR-L858R，LC480 II)图示。
[0040]图8:经过弹回探针富集扩增之后送交测序图。
[0041]图9:弹回探针 HRM 技术(KRAS-G12A，LC4II)图示。
[0042]图10:弹回探针富集扩增HRM技术(KRAS-G12A，LC4II)图示。
【具体实施方式】
[0043]下面结合实施例进一步描述本发明。
[0044]实施例1
使用EGFR基因19号外显子缺失突变样本，按照不同比例浓度与正常人样本DNA进行混合，将突变占1/106、1/105、1/104、1/1000、1/100、1/10比例的突变混合样本以及纯和突变型、野生型样本使用 弹回探针普通扩增法，富集扩增法分别进行扩增，分别进行HRM检测，并将富集扩增PCR产物送交测序。检测灵敏度，富集效率。
[0045]1.1.DNA模板的制备:
1.1.1使用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen , Germany)提取肺癌病人癌旁组织,肿瘤组织DNA，用Nano Drop 2000分光光度计检测浓度，并用灭菌双蒸水稀释至20ng/W，经sanger测序获得野生型样本,突变样本(15bp的缺失)。
[0046]1.1.2将等浓度(20ng/W)突变型与野生型的DNA按所需比例进行混合配比得到 DNA模板。
[0047]1.2.配置10微升反应体系:
50 mmol/L Tris (pH 8.3), 500 mg/L BSA(牛血清)，3 mmol/L MgCl2，200mmol/LdNTP mix,0.4 U TaKaRa Taq HS，IxLC Green plus+ ,0.5 mol/L 弹回探针引物，0.05mol/L限制引物，DNA模板(40ng)，H20补平至10微升。
[0048]弹回探针引物序列: AACGGAGATGTTGCTTCTCTTAATTCCTTGATAGTCTGTCATAGGGACTCTGGAT (SEQ.1D.N0.1)。
[0049]限制引物序列:
AAGGGAAAGACATAGAAAGTGAACATTTAGGA (SEQ.1D.N0.2)
1.3.反应程序(Lightcycler 480 II ):
1.3.1弹回探针HRM程序:
95 °C预变性2min，扩增包括50个循环的95 °C变性15 s，65°C，退火10s，75 V延伸15s。HRM检测包括95 °C变性60 s, 60 V退火60s，从60 °〇到95 °C，以0.02 °〇的速率抬升温度，进行荧光值的收集，最后冷却至40 °C结束。
[0050]1.3.2弹回探针富集扩增HRM程序:
95°C预变性2min，扩增包括50个循环的95 °C变性15 s, 65V退火10s，69 V延伸 15s。
[0051]HRM检测包括95 °C变性60 s, 60 V退火60s，从60 °〇到95 °C，以0.02 °〇的速率抬升温度，进行荧光值的收集，最后冷却至40°C结束。
[0052]1.4.结果分析:
1.4.1 HRM结果分析判断:LC480自带分析软件” Tm calling”分析。
[0053]观察熔解曲线形状，如图3:在75°C左右可以看到杂交峰，突变型由于碱基缺失(15bp-18bp)突变使得探针无法杂交，因此野生型样本为杂交峰最高的，突变占绝对比例的样本(曲线3)所示无杂交峰，因此选择低于75°C以下的温度即可选为Ts值。突变占的越多杂交峰相对越低；除此之外突变样本双链产物峰也会产生变化，曲线I野生型低于产物Tm值(87.50C ) 2°C处有个小的突起杂交峰(注意看纵线所划区域区别)；纯和突变型标本在75°C无明显的杂交峰，且低于产物峰Tm值4°C处有突起杂交峰。多次不同样本，不同比例突变样本实验发现只要低于产物峰2 °C处出现突起杂交峰，此样本则为野生型样本，低于4 1:处出现突起杂交峰则为野生型样本弹回探针HRM如图3:到1%后无法分辨出。因此其灵敏度达不到1%以下的检测灵敏度，实验证明其灵敏度在1%。弹回探针富集扩增HRM如图4:到10/0000后仍然可以分辨出，因此其灵敏度可以检测10/0000突变样本。
[0054]1.4.2 Sanger测序:将弹回探针富集扩增的产物与没有进行富集扩增的产物同时进行测序对比。(由上海华大基因科技有限公司完成测序工作)如图5:图中对比结果可以看出弹回探针富集作用明显，经过富集扩增之后，此缺失突变万分之一的突变样本可以通过组织测序检测出来,突变富集效率为1000倍，10%的突变样本经过富集作用后测序图显中突变样本峰为主要峰，野生型峰仅占20%左右。
[0055]实施例2
使用EGFR基因L858R位点突变样本，按照不同比例浓度与正常人样本DNA进行混合，将突变占1/106、1/105、1/104、1/1000、1/100、1/10比例的突变混合样本以及纯和突变型、野生型样本使用弹回探针普通扩增法，富集扩增法分别进行扩增，分别进行HRM检测，并将富集扩增PCR产物送交测序。检测灵敏度，富集效率。
[0056]2.1.DNA模板的制备:
2.1.1使用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen , Germany)提取肺癌病人癌旁组织,肿瘤组织DNA，，用Nano Drop 2000分光光度计检测浓度，并用灭菌双蒸水稀释至20ng/W，经sanger测序获得野生型样本，突变样本(L858R)。
[0057]2.1.2将等浓度(20ng/W)突变型与野生型的DNA按所需比例进行混合配比得到 DNA模板。
[0058]2.2.配置10微升反应体系:
50 mmol/L Tris (pH 8.3),500 mg/L BSA(牛血清)，3.5 mmol/L MgCl2 ,200 mmol/LdNTP mix, IxLC Green plus+, 0.4 U TaKaRa Taq HS , 0.5 mol/L 弹回探针引物，0.05 mol/L限制引物，DNA模板(40ng)，H20补平至10微升。
[0059]弹回探针引物序列:
TACACAGATTTTGGACTGGTCAAACTGCGCCACCTCCTTACTTTGCC (SEQ.1D.N0.3)
限制引物序列:
CCATGATGATCTGTCCCTCACAGCAG (SEQ.1D.N0.4)
2.3.反应程序(Lig htcycler 480 II ):
2.3.1弹回探针HRM程序:95 °C预变性2min，扩增包括50个循环的95 °C变性15 s，65°C，退火10s，75 °C延伸 15s。
[0060]HRM检测包括95 °C变性60 s, 55 V退火60s，从55 1:到95 °C，以0.02 °〇的速率抬升温度，进行荧光值的收集，最后冷却至40°C结束。
[0061]2.3.2弹回探针富集扩增HRM程序:
95 °C预变性2min，扩增包括50个循环的95 °C变性15 S，65°C退火10s，68 V延伸 15s。
[0062]HRM检测包括95 °C变性60 s, 58 °C退火60s，从58 °〇到95 °C，以0.02 °〇的速率抬升温度，进行荧光值的收集，最后冷却至40°C结束。
[0063]2.4.结果分析:
2.4.1 HRM结果分析判断:LC480自带分析软件” Tm calling”分析。
[0064]图6、图7中包含野生型样本及各混合比例突变样本，突变型弹回探针杂交峰出现在65 °C野生型弹回探针杂交峰在71 °C左右，因此可以选择65 0C-71 1:之间的温度作为Ts值，越接近65 °C，富集效率越高，对野生型模板的抑制扩增作用越明显。图6为普通PCR后进行的弹回探针HRM检测图，图中I号曲线和2号曲线分别表示纯和突变样本和野生型样本，其余的为突变野生混合样本,3号曲线代表突变占1%的样本，低于1%的突变样本无法检测到突变型，因此经过普 通PCR弹回探针HRM检测的灵敏度为1%.图7为经过富集作用的弹回探针HRM检测图，图中I号，4号曲线分别代表纯突变型和野生型样本，2号和3号曲线代表1/105、1/104的检测曲线，如图中所示不低于1/104的突变样本可以检测出来，因此经过弹回探针富集扩增进行HRM检测的灵敏度为1/103。
[0065]2.4.2 Sanger测序:将弹回探针富集扩增的产物与没有进行富集扩增的产物同时进行测序对比。(由上海华大基因科技有限公司完成测序工作)如图8经过弹回探针富集扩增之后送交测序图，1/200的突变样本可以经过测序判断，千分之一的富集产物sanger测序无法分辨，因此此点突变的富集作用达到200倍。低于千分之一的突变经过阻滞富集扩增之后，由于突变模板所占比例很低，因此扩增产物很低，测序信号很弱，无法测序，这也从侧面证明阻滞野生型模板扩增作用明显。
[0066]实施例3
使用KRAS基因位点突变样本，按照不同比例浓度与正常人样本DNA进行混合，将突变占1/106、1/105、1/104、1/1000、1/100、1/10比例的突变混合样本以及纯和突变型、野生型样本使用弹回探针普通扩增法，富集扩增法分别进行扩增，分别进行HRM检测，并将富集扩增PCR产物送交测序。检测灵敏度，富集效率。
[0067]3.1.DNA模板的制备:
3.1.1使用QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen , Germany)提取肺癌病人癌旁组织,肿瘤组织DNA，用Nano Drop 2000分光光度计检测浓度，并用灭菌双蒸水稀释至20ng/W，经sanger测序获得野生型样本，突变样本(G12A)。
[0068]3.1.2将等浓度(20ng/W)突变型与野生型的DNA按所需比例进行混合配比得到 DNA模板。
[0069]3.2.配置10微升反应体系:
50 mmol/L Tris (pH 8.3), 500 mg/L BSA(牛血清)，3 mmol/L MgCl2，200mmol/LdNTP
mix, 0.4 U TaKaRa Taq HS , IxLC Green plus+, 0.5 mol/L 弹回探针引物，0.05mol/L限制引物，DNA模板(40ng)，H20补平至10微升。
[0070]弹回探针引物序列:
TTACTTGTGGTAGTTGGAGCTGTTGGATCATATTCGTCCACA (SEQ.1D.N0.5)
限制引物序列:
GGCCTGCTGAAAATGACTGAATATAAACTTGT (SEQ.1D.N0.6)
3.3.反应程序(Lightcycler 480 II ):
3.3.1弹回探针HRM程序:
95 °C预变性2min，扩增包括55个循环的95 °C变性15 s，65°C，退火10s，75 V延伸 15s。
[0071]HRM检测包括95 °C变性60 s, 55 V退火60s，从55 °〇到95 °C，以0.02 °〇的速率抬升温度，进行荧光值的收集，最后冷却至40°C结束。
[0072]3.3.2弹回探针富集扩增HRM程序:
95 °C预变性2min，扩增包括55个循环的95 °C变性15 s, 65V退火10s，69 V延伸 15s。
[0073]HRM检测包括95 °C变性60 s, 55 °C退火60s，从55 °〇到95 °C，以0.02 °〇的速率抬升温度，进行荧光值的收集，最后冷却至40°C结束。
[0074]3.4.结果分析:
3.4.1 HRM结果分析判断:LC480自带分析软件” Tm calling”分析。
[0075]图9，图10中包含野生型样本及各混合比例突变样本，突变型弹回探针杂交峰出现在66 °C，野生型弹回探针杂交峰在72 °C左右。如图9为普通PCR后进行的弹回探针HRM检测图，图中I号曲线和2号曲线分别表示纯和突变样本和野生型样本，其余的为突变野生混合样本，3号曲 线代表突变占1%的样本，低于1%的突变样本无法检测到突变型，因此经过普通PCR弹回探针HRM检测的灵敏度为1%。
[0076]图10为经过富集作用的弹回探针HRM检测图，图中I号，3号曲线分别代表纯和突变和野生型样本，2号和3号曲线代表1/103突变样本的检测曲线，如图中所示不低于1/103的突变样本可以检测出来，因此经过弹回探针富集扩增进行HRM检测的灵敏度为1/103。
[0077]应用示例:
按照示例要求提取肺癌病人肺癌组织样本47例，同时抽取离心获得Iml以上相对应的血浆样本47例，用QIAGEN blood Midi Kit抽提获得血浆DNA (抽提前，在血浆样本中加A 100-200ng的细菌基因组DNA，抽提产物无需测浓度稀释，直接使用原液DNA1-2微升)。按照实施示例要求进行组织DNA与对应血浆DNA样本EGFR EX19 dele，EX21 L858R基因突变位点的检测，并使用普通的测序方案进行对比。
[0078]结果显示弹回富集HRM技术可以达到与sanger测序的准确性，且在灵敏度上大大提高，在Sanger测序的基础之上检出多例额外的突变样本。
[0079]另外相对应的血浆DNA样本检测结果显示，Sanger测序检测结果与组织测序的检测结果符合率仅仅为10%左右，而本发明技术符合度高达80%，且测出额外组织没有检测出突变的样本一例(可能是组织取样位置造成结果符合度的误差)。[0080]具体突变样本编号总结如下表:_
【权利要求】
1.一种基于弹回探针引物技术的低频突变检测方法，其特征在于，具体步骤为: 步骤1，设计弹回探针引物 弹回探针引物是将探针序列添加在一条扩增引物序列5'端后形成的集探针和引物双重作用的核酸序列，在PCR扩增时，发挥引物5’ -3’延伸的作用；不对称PCR扩增后，形成产物单链结构，探针序列可以弹回与目标杂交序列结合，形成二级结构； (1)设计弹回探针引物序列时，先设计包含有待检测突变位点的特异性扩增引物，产物大小不超过300bp ； (2)将覆盖突变位点的探针序列添加在相应一条扩增引物5'端，使得扩增之后形成的产物单条链，形成弹回蝎型结构； 其中，使突变位点处于探针序列中间三个碱基的位置上；选择与野生型相匹配的探针；并且，在弹回探针引物探针末尾添加两个不互补配对碱基，以免弹回结构为3'端时，弹回探针引物中的探针部分会作为引物延伸； (3)采用不对称扩增的方式，上游高浓度引物为弹回探针引物，下游低浓度引物，称为限制引物，即为另一条未连探针的普通扩增引物；弹回探针引物和限制引物使用浓度比为 10:1-20:1 ； (4)在设计时，限制引物Tm值要比弹回探针引物Tm值高3°C-5°C ； (5)将扩增后形成的弹回结构碱基序列输入网页”The mfold web serve” 一 “DNA folding form”碱基序列输入框中，在阳离子浓度为50mM, Mg2+浓度为3mM,折叠温度为55°C的条件下，确保扩增片段形成弹回蝎型结构，且二级结构形式单一；` 步骤2，制备DNA模板 使用 QIAamp DNA Mini Kit, QIAamp blood DNA Midi Kit,细菌基因组 DNA 提取试剂盒分别抽提组织DNA，血浆DNA，细菌基因组DNA; 步骤3，配置检测体系 检测体系中包含:弹回探针引物和限制引物，还包括:1XPCR buffer, IxLC Greenplus+ +, 0.4 U TaKaRa Taq HS，DNA 模板，ddH20 ； 步骤4，设置反应程序，确定Ts值 使用R°C he荧光定量PCR仪进行反应程序的设置，包括普通PCR扩增设置，富集扩增的设置，HRM检测程序的设置； 富集扩增技术选择的延伸温度为低于野生型扩增产物单链弹回结构解链温度而高于突变型扩增产物单链弹回结构的解链温度； 步骤5，结果的判定 Snager测序图以及HRM结果分析判断，LC480自带分析软件“Tm calling”分析。
【文档编号】C12Q1/68GK103614457SQ201310415839
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年9月13日 优先权日:2013年9月13日
【发明者】孙海燕, 卢大儒 申请人:复旦大学