列号10)的区域。基础结构域为对应于HCV-lb型抗原多肽的1510位~1657位的区域， 基础结构域自身含有TPAETSVRLRAYLNTPG(1531位~1547位，CD4表位4:序列号15)和 GAVQNEVTL(1629 位~1637 位，CD8 表位 8 :序列号 11)。
[0228] 基于图8的氨基酸序列，设计符合双歧杆菌的密码子使用频率（http://www. kazusa.or.jp/codon/)的基因序列（序列号33;对应的氨基酸序列以序列号34表示）。
[0229](实施例6 :双歧杆菌表层表达用HCVNS3多肽基因的设计3)
[0230] 设计图9所示的氨基酸序列，使得基于HCV-lb型多肽的NS3下游侧0 - a - 0 _结 构域（1351位~1509位），将源自NS3的抗原肽与基础结构域的N末端和C末端连结。在 基础结构域中，缺失1351位~1353位的3个氨基酸，将1398~1399位的2个K (赖氨酸） 取代为Q (谷氨酰胺：1398位）和L (亮氨酸：1399位）。
[0231] 图9的氨基酸序列（序列号35)在基础结构域的N末端侧连结含有 QSFLATCINGVCWTVYHGAG (1067位~1086位，CD8表位1:序列号4)的区域，并且在C末端侧 连接含有TPAETSVRLRAYLNTPG(1531位~1547位，⑶4表位4:序列号15)的区域。基础结 构域自身含有EIPFYGKAI (1372位~1380位，CD8表位4:序列号7)、LIFCHSKQL (1391位~ 1399位，将CD8表位5的KK取代为QL :序列号21)、KLSALGVNA(1406位~1414位，CD8表 位 6 :序列号 9)和 VATDALMTGYTCDFDSVIDC(1435 位~1454 位，CD8 表位 7 :序列号 10)。
[0232] 基于图9的氨基酸序列，设计符合双歧杆菌的密码子使用频率（http://www. kazusa.or.jp/codon/)的基因序列（序列号36;对应的氨基酸序列以序列号37表示）。
[0233](实施例7 :双歧杆菌表层表达用HCVNS3多肽基因的设计4)
[0234] 设计图10所示的氨基酸序列，使得基于将HCV-lb型多肽的NS4A区域的一部分 (1677位~1690位）与N末端连结的NS3的0 -折叠桶结构域（1027位~1195位），将源 自NS3的抗原肽与基础结构域的C末端连结。在基础结构域中，缺失1027~1028位的2 个氨基酸和1195位的氨基酸，并且将1144~1145位的2个R(精氨酸）取代为Q(谷氨酰 胺：1144位）和L(亮氨酸：1145位）。
[0235] 图10的氨基酸序列（序列号38)在上述基础结构域的C末端侧连结含有 EITMRSPVFTDNSTPPAVP(1202 位~1220 位，CD4 表位 2 :序列号 13)、ITYSTYGK(1291 位~ 1298 位，CD8 表位 3:序列号 6)和 GGCSGGAYDIIICDECHSTDSTSILGIG(1303 位~1330 位， ⑶4表位3:序列号14)的基础结构域（1)的区域、以及依次含有EIPFYGKAI (1372位~ 1380位，CD8表位4 :序列号7)、KLSALGVNA(1406位~1414位，CD8表位6 :序列号9)和 VATDALMTGYTCDFDSVIDC(1435位~1454位，CD8表位7:序列号10)的区域。基于上述NS4A 区域和NS3的-折叠桶结构域的基础结构域自身含有QSFLATCINGVCWTVYHGAG (1067位~ 1086 位，CD8 表位 1 :序列号 4)、LYLVTRHADVIPVRQL⑶SR(1130 位~1149 位，将 CD4 表位 1 中的RR取代为QL :序列号22)和LLCPSGHVV(1169位~1177位，⑶8表位2 :序列号5)。
[0236] 基于图10的氨基酸序列，设计符合双歧杆菌的密码子使用频率（http://www. kazusa.or. jp/codon/)的基因序列（序列号39;对应的氨基酸序列以序列号40表示）。
[0237](实施例8:皮下肿瘤用转化EL4细胞的制作）
[0238] 由于小鼠不感染HCV，为了在小鼠中制作皮下肿瘤，通过其增殖抑制效果评价本发 明的疫苗的效果，进行了以下的实验。
[0239] 从质粒pSG5/NS3/4A用BamHI切出编码NS3/4A的片段，插入质粒pBApo-CMV Neo(TAKARA)的BamHI位点，由此得到质粒pBApo-CMV Neo/NS3/4A(图11)。制备该质粒 pBApo-CMV Neo/NS3/4A，使用 TransIT-293Transfection Reagent (TAKARA BI0 株式会社 制）导入EL4细胞（小鼠淋巴瘤细胞）。用含有G418800 y g/ml的培养基选择转化EL4细 胞，通过有限稀释法得到了转化EL4细胞（NS3/4A-EL4细胞）的克隆株。
[0240] 为了确认其为转化细胞，进行了 RT-PCR和蛋白质印记。RT-PCR根据通常方法， 从总RNA制备cDNA，使用引物（序列号41 :CGGCCCTCAGGCATGITCGATTCTTC、序列号42: CCGGACAAGATGATCCTGCCCACAATG)在 94°C保温 120 秒后，以 98°C、10 秒、64°C、30 秒、68°C、 40秒为1个循环进行30个循环，扩增编码NS3/4A的DNA片段，进行琼脂糖凝胶电泳后，用 溴化乙锭染色，在UV下确认扩增的DNA片段（图12)。在图12中，1为质粒pSG5/NS3/4A， 2为转化EL4细胞，3为Mock感染EL4细胞，在1和2中确认了目的条带。
[0241] 蛋白质印记通过将细胞提取液进行SDS-PAGE分离、转印到尼龙膜并进行封闭后 用抗体检测NS3/4A蛋白质来进行（图13)。在图13中，在转化EL4细胞检测到73kDa的 NS3/4A蛋白质的条带（列2)。另外，在对照的列3中没有检测到NS3/4A蛋白质的条带。由 此，确认其为NS3/4A-EL4细胞的克隆株。
[0242](实施例9:由B. longum 2165 口服给药获得的抗肿瘤效果的研究）
[0243] 在皮下接种的前一日测定体重（DayO)，将确认为转化体的NS3/4A-EL4细胞移植 到C57BL/6N小鼠的皮下。移植是将1 X 106个的细胞包埋于200 y 1的RPMI 1640&Matrigel 进行皮下接种。将皮下接种日作为Day 1，开始表层表达NS3/4A蛋白质的双歧杆菌的口服给 药实验。
[0244] 口服给药组在各实验区每个区使用个体数6只，将PBS、B. longum2012(GLBP基因 表达株）、B. longum 2165 (GLBP-NS3基因表达株）、非活化B. longum 2165 (将 5X10sCFU/ml 菌液250 y 1在65°C加热5分钟）分别在各个实验区每周3次将5X 107CFU溶解于100 y 1 的PBS进行给药（计13回）。此后，每2天测量肿瘤长径和短径。在图14表示其结果。如 图14所示，在PBS、GLBP给药区，肿瘤体积显著增大，但是在给药2165 (GLBP-NS3)和非活化 2165 (GLBP-NS3)的区中，肿瘤体积的增加被显著抑制。这表示GLBP-NS3基因表达双歧杆菌 具有在细胞表层表达NS3/4A蛋白质的肿瘤细胞的增殖抑制效果。另外，该效果不仅在活菌 能够观察到，在非活化的菌也能观察到。因此，可以认为与双歧杆菌的生死无关而具有作为 抗原的效果。
[0245] 工业上的可利用性
[0246] 根据本发明，能够在双歧杆菌的细胞表层表达和提呈免疫原性多肽。另外，根据本 发明，在将在双歧杆菌的表层提呈例如丙型肝炎病毒抗原多肽的双歧杆菌口服给药的动物 中，能够诱导NS3特异性免疫，因此，能够作为疫苗组合物（例如，口服疫苗）利用。这样的 疫苗组合物能够期待与现有的干扰素疗法等并用，提高HCV慢性感染的治愈率。
【主权项】
1. 一种用于在双歧杆菌的表层表达免疫原性多肽的双歧杆菌表层表达基因，其特征在 于： 该基因含有编码该免疫原性多肽的基因， 该免疫原性多肽为含有基础结构域和至少一个抗原肽的丙型肝炎病毒抗原多肽， 该基础结构域含有选自下述（1)~（4)的多肽中的一个以上， (1) 含有序列号16的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列 同一性的氨基酸序列的多肽； (2) 含有序列号17的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列 同一性的氨基酸序列的多肽； (3) 含有序列号18的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列 同一性的氨基酸序列的多肽；和 (4) 含有序列号19的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列 同一性的氨基酸序列的多肽； 该抗原肽为选自含有序列号4~15的氨基酸序列的肽以及含有与序列号4~15的氨 基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的肽的至少一种， 该至少一个抗原肽与该基础结构域的N末端侧和C末端侧的任一侧连结。2. 如权利要求1所述的的双歧杆菌表层表达基因，其特征在于： (1) 所述基础结构域为含有序列号16的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列 具有至少90%的序列同一性的氣基酸序列的多妝，在该基础结构域的N末端侧连结包含 QSFLATCINGVCWTVYHGAG(序列号4)或与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基 酸序列的肽的区域，在C末端侧连结包含EIPFYGKAI(序列号7)或含有与该氨基酸序列 具有至少90 %的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域，或者连接包含EIPFYGKAI (序列号 7)或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的肽、KLSALGVNA (序 列号9)或含有与该氨基酸序列具有至少90 %的序列同一性的氨基酸序列的肽、和 VATDALMTGYTCDFDSVIDC(序列号10)或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的 氨基酸序列的肽的区域； (2) 所述基础结构域为含有序列号17的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具 有至少90 %的序列同一,性的氨基酸序列的多肽，在该基础结构域的N末端侧连结包含含 有〇5?1^1'(：1如￥0117￥邪46(序列号4)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同 一性的氨基酸序列的肽的区域，在C末端侧连结包含含有EIPFYGKAI (序列号7)的肽或含 有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的肽、含有KLSALGVNA(序列 号9)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的肽、和含有 VATDALMTGYTCDFDSVIDC(序列号10)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一 性的氨基酸序列的肽的区域； (3) 所述基础结构域为含有序列号18的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具 有至少90 %的序列同一,性的氨基酸序列的多肽，在该基础结构域的N末端侧连结包含含有 QSFLATCINGVCWTVYHGAG (序列号4)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90 %的序列同一 性的氨基酸序列的肽的区域，在C末端侧连结包含含有TPAETSVRLRAYLNTPG (序列号15)的 肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域；或 (4)所述基础结构域包含含有序列号19的氨基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列 具有至少90%的序列同一,性的氨基酸序列的多肽，在C末端侧连接包含含有序列号16的氨 基酸序列的多肽或含有与该氨基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的多肽、 含有EIPFYGKAI (序列号7)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90 %的序列同一性的氨基 酸序列的肽、含有KLSALGVNA(序列号9)的肽或含有与该氨基酸序列具有至少90 %的序列 同一性的氨基酸序列的肽、和含有VATDALMTGYTCDFDSVIDC(序列号10)的肽或含有与该氨 基酸序列具有至少90%的序列同一性的氨基酸序列的肽的区域。3. 如权利要求1或2所述的双歧杆菌表层表达基因，其特征在于： 还含有编码源自双歧杆菌的GNB/LNB基质结合膜蛋白的基因，编码所述免疫原性多肽 的基因位于该源自双歧杆菌的GNB/LNB基质结合膜蛋白的3'末端侧。4.一种基因表达用载体，其特征在于： 以能够表达权利要求3所述的双歧杆菌表层表达基因的方式含有该基因。5. -种转化双歧杆菌，其特征在于： 保持权利要求4所述的载体，在细胞表层提呈所述免疫原性多肽。6. -种转化双歧杆菌，其特征在于： 在基因组中以能够表达权利要求3所述的双歧杆菌表层表达基因的方式含有该基因， 在细胞表层提呈所述免疫原性多肽。7.-种丙型肝炎疫苗组合物，其特征在于： 含有权利要求5或6所述的转化双歧杆菌。8. 如权利要求7所述的疫苗组合物，其特征在于： 其为口服疫苗。9. 一种设计用于在双歧杆菌的表层表达的免疫原性多肽的方法，其特征在于，包括： 选择保持立体结构并且具有细胞分泌能力的基础结构域和至少一个抗原肽的工序；以 及 设计将该至少一个抗原肽与该基础结构域的N末端侧和C末端侧的任一侧连结的合成 多肽的工序。10. 如权利要求9所述的方法，其特征在于： 所述基础结构域含有至少一个CD4表位或CD8表位或者含有其双方。11. 一种转化双歧杆菌，其特征在于： 在细胞表层表达在癌细胞的表层特异性表达的多肽。12. 如权利要求11所述的转化双歧杆菌，其特征在于： 还含有编码源自双歧杆菌的GNB/LNB基质结合膜蛋白的基因。13. -种癌疫苗，其特征在于： 含有权利要求11或12所述的转化双歧杆菌。
【专利摘要】一种用于在双歧杆菌的表层表达免疫原性多肽的双歧杆菌表层表达基因，该基因含有编码该免疫原性多肽的基因，该免疫原性多肽含有规定的基础结构域和至少一个抗原肽，该至少一个抗原肽与该基础结构域的N末端侧和C末端侧的任一侧连结。本发明的双歧杆菌表层表达基因还能够含有编码源自双歧杆菌的GNB/LNB基质结合膜蛋白的基因。
【IPC分类】C12N1/21, A61K35/74, A61K39/29, A61P37/04, C12N15/09, A61P31/14, A61K48/00, A61K39/00
【公开号】CN105073989
【申请号】CN201480009513
【发明人】白川利朗, 堀田博, 片山高岭
【申请人】国立大学法人神户大学
【公开日】2015年11月18日
【申请日】2014年2月14日
【公告号】WO2014129412A1