后将蛋白质转移到预先用甲醇活化的 聚偏二氟乙烯膜（PVDF)上，利用0.5%的鸡血清进行封闭，将乳铁蛋白多克隆抗体溶液按 I:6000稀释后，室温孵育2h，PBST洗后加入羊抗兔辣根过氧化物酶标记IgG抗体（I:5000 稀释），PBST洗膜，DAB显色剂显色后扫描结果。
[0074] 2试验结果
[0075] 2. 1乳铁蛋白多克隆抗体纯度
[0076]SDS-PAGE结果如图1所示，经过免疫磁珠法和蛋白A亲和层析法2步纯化后得到 的乳铁蛋白多克隆抗体重链清晰可见，表明通过纯化得到了纯度较高的乳铁蛋白多克隆抗 体。
[0077] 2. 2乳铁蛋白多克隆抗体效价
[0078] 图2是抗体的效价曲线图，抗体经过纯化以后，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测得其 浓度为11. 〇2mg/mL，ELISA方法检测抗体的效价为1 :128000。棋盘法同时确定包被抗原和 纯化抗体的最适浓度。用包被液稀释乳铁蛋白标准品到5、2. 5、1. 25、0. 625、0. 3125yg/mL， 稀释抗体到I:2000、1 :4000、1 :8000、1 :16000、1 :32000、1 :64000 和 1 :128000。棋盘法结 果显示，在包被抗原浓度为0. 625yg/mL及抗体稀释倍数为1:64000时，OD45。值最接近于 1〇
[0079] 2. 3多克隆抗体检出限测定结果
[0080] 试验结果如图3所示，线性方程为Y= 88. 329X-338 (R2= 0? 9985);
[0081] 抑制率（％) = (1-标准品溶液孔的吸光度值（B)/阴性对照孔的吸光度值 (BO))X100 % 0
[0082] 图 3 中蛋白浓度为 0 (阴性对照）、8yg/mL、12yg/mL、16yg/mL、20yg/mL、24yg/ mL、28yg/mL、32yg/mL、36yg/mL和 40yg/mL的乳铁蛋白对应的OD值分别为：2. 300， 2. 120,L825,L537,L322,L166,L045,0? 916,0? 830 和 0? 714 ;抑制率分别为 100 %， 92. 19%，79. 37%，66. 84%，57. 48%，50. 71%，45. 46%，39. 83%，36. 11 %和 31. 05%。 [0083] 试验结果表明，用本发明制备的多克隆抗体所建立的检测乳铁蛋白的竞争性 ELISA的IC50值为24. 5yg/mL，检测限为11. 2yg/mL，检测线性范围为8-40yg/mL。
[0084] 2. 4乳腺组织及乳制品中乳铁蛋白浓度的测定
[0085] 利用工作曲线测定乳腺组织样品及乳制品中乳铁蛋白浓度，测得5份乳腺组织样 品中乳铁蛋白浓度范围在14. 72yg/g总蛋白至18.64yg/g总蛋白，平均值为16. 13yg/ g总蛋白，相对标准偏差为11. 05%，液态奶中乳铁蛋白浓度接近于0,奶粉中乳铁蛋白浓度 范围为4. 91yg/g至5. 73yg/g，平均值为5. 28yg/g，相对标准偏差为6. 42%。
[0086] 2. 5乳铁蛋白抗体特异性
[0087]Western-blot结果如图4所示，纯化后的抗体能够与乳铁蛋白标准品专一,性结 合，表明本发明获得的抗体能够特异性识别乳铁蛋白。
[0088] 图5的Western-blot结果显示，纯化后的本发明抗体与奶牛乳腺组织中提取的乳 铁蛋白具有反应性，同时对奶粉中的乳铁蛋白也有特异反应性，可用于检测奶牛乳腺组织 和奶制品中的乳铁蛋白。
[0089]试验例1本发明兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体与商品化抗体性能比较试验
[0090] 1效价比较试验
[0091] 1.1试验方法
[0092] 将乳铁蛋白标准品用包被液稀释至5、2. 5、1. 25、0. 625、0. 31yg/mL，每孔IOOyL 包被酶标板，4°C过夜，并用PBS做阴性对照，次日弃去孔内液体，每孔加入200yL封闭液 (1%卵清白蛋白（OVA))，置37°C恒温箱lh，倾去液体后，用洗涤缓冲液（PBST)洗涤4次，每 次静置3min后迅速倾去洗涤液，拍干。取不同稀释度的纯化后抗体和商品化抗体（购自美 国Sigma公司）（I:2000、1 :4000、1 :8000、1 :16000、1 :32000、1 :64000 和I:128000)，每个 稀释度3个重复，37°C温育lh，然后倾去液体，PBST洗涤，倾去液体，拍干。每孔加100yL 按I:5000稀释的羊抗兔IgG-HRP抗体，37°C温育lh，PBST洗涤，倾去液体，拍干。每孔加 入100yL新鲜配制的底物溶液A和底物溶液B，室温孵育20min。每孔加入50yL终止液 (H2S04, 2mol/L)，5min后在酶标仪上测定450nm下的吸光度值。若待测孔OD45。大于或等于 阴性对照孔的2. 1倍，即认为是阳性值，从而得出抗体的效价。
[0093] 1. 2试验结果
[0094] 本发明实施例1制备的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体和Sigma销售抗体效价结果比 较见表1和表2。本发明制备的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体效价为1 :128000,而Sigma销 售的抗牛乳铁蛋白多克隆抗体效价仅为I:32000。
[0095] 表1本发明制备的多克隆抗体效价（0D值）
[0096]
[0097] 注：将乳铁蛋白稀释成5、2. 5、1. 25、0. 625、0. 3125yg/mL，依次加入1-5列中，A-G 行为不同稀释比例的纯化抗体（I:2000、1 :4000、1 :8000、1 :16000、1 :32000、1 :64000和 1 : 128000)，H行为PBS阴性对照，表中数据为3个重复的平均值。
[0098] 表2Sigma销售牛乳铁蛋白抗体的效价测定（0D值）
[0099]
[0100] 注：将乳铁蛋白稀释成5、2. 5、1. 25yg/mL，依次加入1-3列中，A-G行为不同稀 释比例的Sigma销售抗体（I:2000、1 :4000、1 :8000、1 :16000、1 :32000、1 :64000 和 1 : 128000)，H行为PBS阴性对照，表中数据为3个重复的平均值。
[0101] Sigma抗体浓度为15. 8mg/mL，棋盘法同时确定包被抗原和Sigma抗体的最适浓 度。用包被液稀释乳铁蛋白标准品到5、2. 5和1. 25yg/mL，稀释抗体到1 :2000、1 :4000、 I:8000、1 :16000、1 :32000、1 :64000和1 :128000。棋盘法结果显示，在包被抗原浓度为 2. 5yg/mL及抗体稀释倍数为1:8000时，OD45。值最接近于1。
[0102] 2工作曲线比较试验
[0103] 2.1试验方法
[0104] 用竞争性ELISA测定Sigma抗体与乳铁蛋白之间的抑制率。步骤同实施例1的 1. 8。根据OD45。值绘制标准曲线，计算该抗体与乳铁蛋白的抑制率。
[0105] 2. 2试验结果
[0106] 本发明制备的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体与乳铁蛋白的抑制率见图6,抑制抗 原与本发明制备的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗体结合50%时乳铁蛋白的浓度（IC5。）为 33. 5yg/mL〇
[0107] 竞争性ELISA结果见图6 (标样设8个浓度梯度，从40yg/mL起始倍比稀释，每 个浓度设3个重复），根据图6可见，抑制抗原与Sigma销售的牛乳铁蛋白多克隆抗体结合 50%时乳铁蛋白的浓度（1(：5。）为33.5 1^/111匕
[0108] 3特异性比较试验
[0109] 3.1试验方法
[0110] 以0. 625iig/mL酷蛋白和2. 5iig/mL乳铁蛋白纯品分别包被酶标版，每孔100iiL， 4°C过夜，并用PBS做阴性对照，次日弃去孔内液体，每孔加入200yL封闭液（1 %卵清白蛋 白（OVA))，置37°C恒温箱lh，倾去液体后，用洗涤缓冲液（PBST)洗涤4次，每次静置3min 后迅速倾去洗涤液，拍干。将自制纯化后抗体（I:64000)和Sigma销售抗体（I:8000)，每 个稀释度3个重复，37°C温育lh，然后倾去液体，PBST洗涤，倾去液体，拍干。每孔加100yL 按I:5000稀释的羊抗兔IgG-HRP抗体，37°C温育lh，PBST洗涤，倾去液体，拍干。每孔加 入100yL新鲜配制的底物溶液A和底物溶液B，室温孵育20min。每孔加入50yL终止液 (H2S04, 2mol/L)，5min后在酶标仪上测定450nm下的吸光度值。
[0111] 3. 2试验结果
[0112] 从表3的ELISA试验结果可见，本发明实施例1制备的兔抗牛乳铁蛋白多克隆抗 体以及从Sigma购买的牛乳铁蛋白多克隆抗体仅对乳铁蛋白专一性结合，而与酪蛋白无结 合反应，均具有有良好特异性。
[0113] 表3ELISA试验结果
[0114]
[0115] 试验例2抗原免疫最佳程序筛选试验
[0116]I. 1抗原免疫剂量筛选
[0117] 选择6只健康纯种新西兰大白兔，随机分为3组。试验开始第一周，分别将0.lmg、 0? 5mg和I.Omg乳铁蛋白与50ygCpG佐剂溶于ImLPBS中，与Al(OH)3Q: 5,v/v)混合后，米 用皮下多点注射法，每只兔注射ImL含有复合佐剂的蛋白溶液（分别含100、500和1000yg 乳铁蛋白），4周后，同样方法背部皮下多点注射含有该复合佐剂的乳铁蛋白（分别含50、 250和500yg乳铁蛋白），以后每2周重复1次，每次免疫后的第7天耳缘静脉采血，ELISA 方法检测抗血清效价。结果见表4。
[0118] 由表4可知，抗体效价随免疫剂量的提高而有所升高，考虑到免疫剂量过高不利 于动物健康及抗原吸收，因此本发明中采用500yg乳铁蛋白进行初始免疫，应用250yg乳 铁蛋白进行加强免疫。
[0119] 表4抗原免疫剂量不同所得抗体效价检测结果
[0120]
[0121] 1. 2抗原免疫佐剂筛选
[0122] 选择4只健康纯种新西兰大白兔，随机分为2组。试验开始第1周，将0. 5mg乳铁 蛋白与50ygCpG佐剂溶于ImLPBS中，与A1(0H)3(1:5,v/v)混合后，采用皮下多点注射 法给其中1组新西兰白兔免疫，每只兔免疫ImL含有复合佐剂的蛋白溶液