例中所述实验方法， 如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均从商业途径获得。
[0023] 实施例中所涉及的实验材料： A12菌液制备方法为：依据公开号为CN103773774A专利实施例1制备获得的A12菌株 (申请人自命名），与该实施例步骤（2)对应的单菌落(不同于该文献公开的B12)，挑取该单 菌落，加入2XTY-AG液体培养基培养至平台期，菌液OD45。值为1. 2; D5菌液由江苏省农业科学院农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实验室提供， 为含有非" 0 "类型的Anti-IdscFv，细菌处于生长平台期，菌液OD45。值为1. 2 ; 噬菌体载体PIT2是提取A12质粒后，由NcoI、NotI双酶切所得； NcoI、NotI酶、T4DNA连接酶、辅助噬菌体M13K07均购于NEB公司； PCR试剂购于东盛公司； 质粒提取试剂盒、PCR产物凝胶回收试剂盒购于Axygen公司； 大肠杆菌TGl菌株购于英国Source BioScience公司； TGl化学转化感受态细胞：按照J.莎姆布鲁克所著《分子克隆实验指南》（第三版）（黄 培堂译，2005)所述方法制备； HRP-Anti-M13标签抗体购于GE公司； CryIAb毒素购于上海佑隆生物科技有限公司； 96孔酶标板（Costar2592)购于美国Corning公司； 实施例涉及的培养基： TYE培养基：在900ml双蒸水中加入15.0g琼脂糖，8gNaCl，10g胰蛋白胨，5g酵 母提取物，用双蒸水定容到IL，置于高压灭菌锅中，121°C，20min灭菌，冷却后，置于4°C保 存备用； TYE-AG平板：在TYE培养基中加入终浓度为100yg/ml氨苄青霉素和质量比为1 %葡 萄糖； 2XTY液体培养基：在900mL双蒸水中加入16g胰蛋白胨，10g酵母提取物和5g NaCl，搅拌混匀，用双蒸水定容到IL，置于高压灭菌锅中，121°C，20min灭菌，冷却后，置于 4 °C保存备用； 2 XTY-A培养基：在2XTY的培养基中加入终浓度为100yg/ml氨苄青霉素； TY-甘油培养基：2XTY液体培养基中加入终浓度为的15%甘油； 2XTY-AKG培养基：在2XTY的培养基中加入终浓度为100yg/ml氨苄青霉素、50yg/ml卡那霉素和质量比为1 %葡萄糖； 2XTY-AG培养基：在2XTY的培养基中加入终浓度为100yg/ml氨苄青霉素和质量 比为1 %葡萄糖； 2XTY-AK培养基：在2XTY的培养基中加入终浓度为100yg/ml氨苄青霉素、50yg/ml卡那霉素； PBS:称取NaCl8.0g，KCl0.2g，Na2HP04.12H20 2.9g，KH2P04 0.2g，分别加入到 蒸馏水中，充分溶解后，定容到IL; PBST:在PBS中加入体积比为0. 05%的吐温-20 ; 3 %MPBS:PBS中加入质量比为3%的脱脂奶粉； PEG/NaCl:称取 20gPEG8 000,14.61gNaCl，加 80ml去离子水，定容到 100ml，置 于高压灭菌锅中，121°C，20min灭菌，冷却后，置于4°C保存备用。
[0024] 实施例涉及的引物SEQIDNo. 6、SEQIDNo. 7均由上海生工公司合成； 实施例涉及的改型抗体核酸序列SEQIDNo. 5由南京金斯瑞公司合成，并连接到pUC57 载体上，构成swine-A12_pUC57质粒； 猪源改型抗体swine-A12-pIT2测序由南京金斯瑞公司完成； 小菜蛾生物测定由江苏省农业科学院农业部农产品质量安全控制技术与标准重点实 验室完成。
[0025] 实施例1猪源化改型抗体序列的确定及合成 I. 1参考Almagro等（2006)的方法并略加改进，猪源抗体的VH和VL序列从GenBank得 至1J，分别利用关键词"5k? immunoglobulinheavychainvariable"（"猪源抗体重 链可变区"，VH)和immunoglobulinlightchainvariable"（"猪源抗体轻链 可变区"VL)搜索"protein"（"蛋白")，结果VH搜到337个蛋白，VL搜到94个蛋白，分别对 VH和VL进行氨基酸序列比对及分析，从而确定保守部分，并根据IMGT的鉴定方法（Lefranc etal. ,2003)(Lefranc,M.P. ;Pommie,C. ;Ruiz,M. ;Giudicelli,V. ;Foulquier, E. ;Truong,L. ;Thouvenin-Contet,V. ;Lefranc,G.IMGTuniquenumberingfor immunoglobulinandTcellreceptorvariabledomainsandIgsuperfamilyV-Iike domains.ZfeK.C咖a 2003，27: 55-77.)从而确定VH和VL的FR1、FR2、FR3 和FR4,猪源抗体的VH和VL氨基酸序列SEQIDNo. 1和SEQIDNo. 2分别如图1、图2所 不。
[0026] 1. 2依据公开号为CN103773774A专利实施例1公开的筛选方法，获得人源化抗 独特型单链抗体，申请人将该抗体自命名为A12 (不同于B12)，挑取产生A12抗体的单菌落 (即与该实施例1步骤（2)所对应的上清液)，加入2XTY-AG液体培养基培养至平台期，菌 液OD45。值为1. 2 〇
[0027]A12的氨基酸序列如SEQIDNo. 3所示，其中下划线部分为CDR，其他为FR序列；
A12的具体结构如图3所示，图3中，H(重链）CDRl:48-57;CDR2 :72-86;CDR3 : 121-127;L(轻链）CDRl:178-188 ;CDR2 :204-210 ;CDR3 :243-251。
[0028] 将人源单链抗体A12的6个⑶R植入猪源抗体的相对应部分，再加上连接重、轻链 的（GGGGS)3Linker即构建成功了猪源抗体的氨基酸序列如SEQIDNo. 4表示，其中下划 线部分为CDR，其他为FR序列；
经过反向翻译并且在两端加上NcoI、NotI酶切位点及相对应保护碱基的核酸 序列如SEQIDNo. 5表示，NcoI酶切位点识别序列：CATGG;NotI酶切位点识别序列： GCGGCCGC;首端下划线部分NcoI酶切位点及相对应保护碱基，尾部下划线部分NotI酶切 位点及相对应保护碱基，其他部分碱基就是要合成猪源抗体的核酸序列： SEQIDNo. 5
将SEQIDNo. 5核酸序列送南京金斯瑞公司进行人工合成，所得到的片段连接到该公 司的通用载体PUC57上，即为合成的swine-A12-pUC57质粒。
[0029] 实施例2猪源化改型抗体的表达载体替换成pIT2 金斯瑞公司合成得到的核酸片段连接的载体是PUC57 (图4)，为了能在噬菌体展示通 用的载体PIT2上表达，利用所设NcoI、NotI的酶切位点对其进行双酶切，如图5所示， 可见完整质粒被切成2个部分，将较小的735bp的目的片段，使用PCR产物凝胶回收试剂盒 购进行回收，并用T4DNA连接酶16 °C下连接过夜，连接载体是pIT2 (如图6所示)，次日 获得连接产物； 取5W连接产物加入到100WTGl化学感受态细胞中，混匀，置于冰上放置30min; 然后将混合物转移至42°C热击Imin，并迅速冰浴2min;再向混合物中加入900W2XTY 液体培养基，37°C，200rpm复苏1小时；然后将复苏产物均匀涂布于TYE-AG平板中， 37°C过夜培养； 次日，随机挑取单克隆菌落至ImL2XTY-A培养基中，共挑取5个，37°C，250rpm过 夜培养，制备成swine-A12-pIT2菌液，此时细菌处于平台期，菌液OD45。值为1. 2。将这5份 菌液彻底混匀并分别分装成两部分，一部分用于PCR鉴定及测序，另一部分加甘油（终浓度 为15%)混匀后于-80 °C保存备用。
[0030] 验证swine-A12_pIT2菌液及测序所涉及的引物序列： SEQIDNo. 6 (LMB3-F):CAGGAAACAGCTATGAC; SEQIDNo.7(pHENseq-R): CTATGCGGCCCCATTCA; 其中，LMB3-F是扩增片段全长的上游引物，pHENseq-R是扩增片段全长的下游引物。 分别以SEQIDNo.6 (LMB3-F)和SEQIDNo.7 (pHENseq-R)为引物，swine-A12-pIT2 菌 液为模板扩增PCR; PCR扩增体系为：2XPCRPremix10yl、10yM的LMB3-F引物和pHENseq-R引物各IU1、swine_A12-pIT2 菌液 2y1、ddH20 补足至 20y1 ; PCR扩增条件：94°C5min;94°C45s，56°C45s，72°CImin，共 30 个循环；72 °C延伸10min，4 °C保持； PCR反应结束后，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物是否为941bp的单一产物，若是即 可将对应的菌液或者质粒送南京金斯瑞公司