测序。测序的结果经过氨基酸序列比对， 所送的菌液序列同SEQIDNo.4完全一致，表明已准确的替换了表达载体，成功构建了 swine_A12-pIT2 质粒。
[0031] 实施例3猪源化改型抗体的ELISA鉴定 3. 1小菜蛾BBMV制备 参照Wolfersberger的实验方法（Wolfersberger，1987)，使用Mg-EGTA沉降法制备小 菜蛾中肠BBMV，具体做法为：取小菜蛾4龄末期幼虫，提取中肠，在预冷的0. 15MNaCl中 清洗，每500只中肠加入3mL匀浆缓冲液；3次反复匀浆冰浴后，取适量加入24mMMgCl2 后涡旋混匀，冰浴并离心后将上清液转入新的高速离心管中再离心；弃上清后倒置离心管 待液体流尽后，将沉淀重悬于HEPES缓冲液中，分装后于-80°C贮存备用；BBMV蛋白浓度通 过Bradford法测定。
[0032] 3. 2具有杀虫活性的猪源改型抗体的ELISA鉴定 取实施例2中处于平台期的猪源化改型抗体Swine-A12-pIT2菌液、A12菌液(人源化 对照)、D5菌液（阴性对照)各300yL，分别加入到30mL2XTY-AG培养基中，于250rpm、 37°C条件下振荡培养至OD6m=O. 4 (约2h)后，分别加入2XIO11辅助噬菌体M13K07, 200 rpm、37 °C振荡培养Ih;于1800 ^?条件下离心10min，去上清液，分别用30mL2XTY-AK 培养基重悬沉淀，200rpm、30 °C振荡培养过夜；次日于1800g件下离心10min，分别加 入7. 5mLPEG/NaCl充分混匀后冰浴Ih;然后于3300 ^?条件下离心30min，弃上清，再分 别用10mLPBS重新悬浮沉淀，最后再于11600 ^?条件下离心10min，分别取上清液。这 样就有swine-A12-pIT2菌液、A12菌液(人源化对照)、D5菌液(阴性对照）3种表达上清液， 作为猪源化改型样品用于后续样品检测及生物测定； 取30ug/mL小菜蛾中肠BBMV包被96微孔板过夜，100 yL/孔，次日每孔加入200 yL3% MPBS溶液，37 °C静置孵育2 h进行封闭；每孔用250 yLPBST洗板，然后加入100 yL /孔的上清液(一抗)，37 °C孵育2 h;每孔用250 yLPBST洗板，加入1:5000稀释的 HRP-Anti-M13标签抗体，37 °C孵育I h ;PBST洗板后加入100 yL/孔的四甲基联苯胺（ TMB)显色液，37 °C下反应10~20 min，最后加入浓度为2 M的H2SO4快速终止反应，并用 Thermo全自动酶标仪，测定OD45。值。
[0033] 本实施例测定具有杀虫活性的猪源化改型抗体swine-A12-pIT2的OD45。值， 检测结果如图7所示，图7中A12为人源化对照，CK-为阴性对照D5,猪源化改型抗体 SWine-A12-pIT2的OD45。值略低于人源化的A12,但经单因素方差分析表明二者之间无明显 差异，但都显著高于阴性对照D5。可见猪源化改型抗体Swine-A12-pIT2同小菜蛾中场BBMV 的结合能力同人源化的A12基本相当，初步推测其具有杀虫活性。
[0034] 实施例4猪源化改型抗体对小菜蛾的生物测定 将新鲜甘蓝叶片分别放入IOmL实施例3制备的猪源化改型抗体Swine-A12-pIT2表达 上清液中，浸渍10s后取出晾干；人源化对照为实施例3制备的A12表达上清液，阴性对照 为实施例3制备的D5表达上清液，空白对照为清水。
[0035] 将处理后的甘蓝叶片分别放入垫有滤纸的培养皿，每皿接入30头已饥饿4h的小 菜蛾3龄幼虫，然后置培养皿于温度为25±1 °C，相对湿度65±5 %，光周期L:D= 14: 10 的培养箱内饲养。24、48、72h后分别观察、记录死亡虫数，并于每次观察后更换新的处理叶 或对照叶继续饲养直到实验结束。取出幼虫检查时以小毛笔轻触虫体，无明显反应者为死 亡。各处理使用30头3龄幼虫，每处理3次重复。试虫死亡率采用Abbott公式对死亡率 进行校正，并以平均数土标准误表示（3次重复试验)。
[0036] 校正死亡率=(处理死亡率一对照死亡率）/(1一对照死亡率）X 100% 各处理时间相同时各个样品之间的比较采用单因素方差分析（One-wayAN0VA)和Tukey显著性检验，使用SPSS软件进行数据处理，处理结果如表1所示： 表1猪源化改型抗体对小菜蛾的杀虫效果
注：表中各列数据后不同小写字母表示差异显著（KO. 01)。
[0037] 由表1可见，经过24h的处理，猪源化杀虫蛋白swine-A12-pIT2比人源化A12杀 虫效果显著降低；但是48和72h的处理后，Swine-A12-pIT2跟A12杀虫效果无明显差异， 但是杀虫效果都显著的高于阴性对照的D5(CK)，因此猪源化改型抗体Swine-A12-pIT2具 有显著的杀虫活性，且与小菜蛾BBMV具有较高亲和力。
[0038] 由上述实施例可见，这种在动物源抗体的基础上将动物源抗体⑶R区基因替换为 人源抗体CDR区基因的抗体改造方法，可快速获得多种动物来源的改型抗体。
【主权项】
1. 一种具有杀虫活性的猪源化改型抗体，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 5所示，氨基酸序 列如SEQ ID NO. 4所示。2. 如权利要求1所述具有杀虫活性的猪源化改型抗体的制备方法，其特征在于，具体 步骤如下： (a)由GenBank筛选猪源抗体，并分别对其VH和VL进行氨基酸序列比对分析，确定保 守序列，再根据頂GT鉴定方法分别确定VH和VL的FR1、FR2、FR3和FR4 ; 其中，VH和VL序列分别如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示； (b) 将人源化抗独特型单链抗体A12的6个⑶R植入猪源抗体的相对应部分，再加上连 接重、轻链的（GGGGS)3 Linker，即获得猪源抗体，其氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示； 反向翻译所述猪源抗体氨基酸序列，并且在获得的核苷酸序列两端加上NcoI、NotI酶切位点及对应的碱基保护核酸序列，最终获得的核苷酸序列如SEQIDNo. 5所示；将核苷 酸序列SEQIDNo.5连接载体pUC57上，获得合成质粒swine-A12-pUC57 ; (c) 利用Nco I、Not I对合成质粒Swine-A12-pUC57进行双酶切，回收目的片段，利用 T4 DNA连接酶将回收的目片段接到pIT2载体上，次日将连接产物转入TGl化学转化感受态 细胞中，然后将转化菌涂布于TYE-AG平板，37°C培养过夜；次日随机挑取单克隆菌落至ImL 2父1￥4培养基中，于37°(：，250印111摇床过夜培养，获得8?1116412-?几2菌液 ； (d) 以SEQIDNo.6和SEQIDNo.7为引物，以swine-A12-pIT2菌液为模板进行PCR 扩增，对扩增产物进行凝胶电泳，所获得的941 bp的单一条带，即为所述猪源化改型抗体。3. 根据权利要求2所述具有杀虫活性的猪源化改型抗体的制备方法，其特征在于，步 骤（d)所述PCR扩增是指： PCR 扩增体系为：2X PCRPremix 10yl、10 yM 的引物各 lyl、swine-A12-pIT2 菌液 2y UddH2O 补足至 20yl ; PCR扩增条件：94 °C 5 min;94 °C 45 s，56 °C 45 s，72 °C I min，共 30 个循环；72 °C延伸10 min，4 °C保持。4. 一种含如权利要求1所述具有杀虫活性的猪源化改型抗体核苷酸序列的原核载体。5. 如权利要求1所述具有杀虫活性的猪源化改型抗体在农业虫害防治中的应用。6. -种含如权利要求1所述具有杀虫活性的猪源化改型抗体的基因材料。
【专利摘要】本发明涉及一种具有杀虫活性的猪源化改型抗体及其制备方法与应用，通过生物信息学预测猪源化抗体重、轻链可变区的8个FR，并植入抗独特型单链抗体A12的6个CDR来确定猪源化改型抗体的序列，进行人工合成，从而构建A12的猪源化的改型抗体，并通过替换易于噬菌体表达的PIT2载体，获得猪源化改型抗体；该改型抗体与小菜蛾中肠BBMV具有一定的结合能力，且具有杀虫活性；本发明利用生物信息学预测和人工合成的方法可快速高效的地获得动物来源的改型抗体，使用这些基因工程抗体技术探索开发新型且安全性高的杀虫蛋白资源的可能性，也为发展新型杀虫白提供了新的思路和方向。
【IPC分类】A01N47/44, C12N15/13, A01P7/04, C07K16/46, C12N15/70, C12N15/10
【公开号】CN105085683
【申请号】CN201510587402
【发明人】刘贤金, 仲建锋, 张霄, 刘媛, 何鑫, 胡晓丹, 武爱华, 徐重新, 谢雅晶, 梁晓, 林曼曼
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月16日