br>[0070] 细胞体外增殖曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要 指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。
[0071] ?培养细胞：按照上述CIK培养流程培养CIK细胞，在培养的第1、3、5、7、9、11、 13、15天取200y1培养物做下述染色。
[0072] ?呈色：每孔加入MTT溶液（5mg/ml) 20y1，37°C孵箱中继续孵育4h，终止培养，小 心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮生长的细胞，需离心（lOOOrpm，5min)，然后弃去孔内培养 液。每孔加入150ulDMS0,振荡10min，使结晶物充分溶解。
[0073] ?比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以 时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。由图1中的样品1可知在CIK培养的第 7-13天是细胞的对数生长期。
[0074] 实施例3
[0075]CIK诱导培养：
[0076] 鲁分离的PBMC计数后，按7XIO5个/ml密度接种。
[0077] ?将细胞加入CD3mAb(20ng/ml)、CD28mAb(70ng/ml)包被的T175 培养瓶中。
[0078] ?补充淋巴细胞完全培养基至100ml，加入IL_2(700IU/ml)。
[0079] ?转天向培养瓶中分别加入IFN-y(800IU/ml)、IL-Ia(70IU/ml)。
[0080] ?第 3 天，细胞计数，加入IL-2 (700IU/ml)。
[0081] ?第5天，细胞计数，加入100mL淋巴细胞完全培养基、IL-2(700IU/ml)。
[0082] 鲁第7天，细胞计数，将细胞悬液移入细胞培养袋，加入200ml淋巴细胞完全培养 基、CD3mAb(20ng/ml)、CD28mAb(70ng/ml)、IL-2 (700IU/ml)。
[0083] ?每隔2天补加与原培养体系同等体积的淋巴细胞完全培养基和IL-2 (700IU/ ml) 〇
[0084] 鲁第13天和16天，细胞计数，收获细胞。
[0085] 备注：每种因子后面括号内数值表示各因子在培养体系中的终浓度。
[0086] CIK细胞体外增殖曲线：
[0087] 细胞体外增殖曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要 指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。
[0088] ?培养细胞：按照上述CIK培养流程培养CIK细胞，在培养的第1、3、5、7、9、11、 13、15天取200y1培养物做下述染色。
[0089] ?呈色：每孔加入MTT溶液（5mg/ml) 20y1，37°C孵箱中继续孵育4h，终止培养，小 心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮生长的细胞，需离心（lOOOrpm，5min)，然后弃去孔内培养 液。每孔加入150ulDMS0,振荡lOmin，使结晶物充分溶解。
[0090] ?比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以 时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。由图1中的样品2可知在CIK培养的第 7-13天是细胞的对数生长期。
[0091] 实施例4
[0092]CIK诱导培养：
[0093] ?分离的PBMC计数后，按9XIO5个/ml密度接种。
[0094] ?将细胞加入CD3mAb(29ng/ml)、CD28mAb(99ng/ml)包被的T175 培养瓶中。
[0095] ?补充淋巴细胞完全培养基至100ml，加入IL-2(999IU/ml)。
[0096] ?转天向培养瓶中分别加入IFN-y(999IU/ml)、IL-Ia(99IU/ml)。
[0097] ?第 3 天，细胞计数，加入IL-2 (999IU/ml)。
[0098] ?第5天，细胞计数，加入100mL淋巴细胞完全培养基、IL-2 (999IU/ml)。
[0099] 鲁第7天，细胞计数，将细胞悬液移入细胞培养袋，加入200ml淋巴细胞完全培养 基、CD3mAb(29ng/ml)、CD28mAb(99ng/ml)、IL-2 (999IU/ml)。
[0100] ?每隔2天补加与原培养体系同等体积的淋巴细胞完全培养基和IL-2 (999IU/ ml) 〇
[0101] ?第13天和16天，细胞计数，收获细胞。
[0102] 备注：每种因子后面括号内数值表示各因子在培养体系中的终浓度。
[0103]CIK细胞体外增殖曲线：
[0104] 细胞体外增殖曲线是测定细胞绝对生长数的常用方法，也是判定细胞活力的重要 指标，是培养细胞生物学特性的基本参数之一。
[0105] ?培养细胞：按照上述CIK培养流程培养CIK细胞，在培养的第1、3、5、7、9、11、 13、15天取200y1培养物做下述染色。
[0106] ?呈色：每孔加入MTT溶液（5mg/ml) 20y1，37°C孵箱中继续孵育4h，终止培养，小 心吸弃孔内培养上清液。对于悬浮生长的细胞，需离心（lOOOrpm，5min)，然后弃去孔内培养 液。每孔加入150ulDMS0,振荡lOmin，使结晶物充分溶解。
[0107] ?比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以 时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。由图1中的样品3可知在CIK培养的第 7-13天是细胞的对数生长期。
[0108] 实施例5
[0109] CIK细胞对肿瘤细胞（Hela细胞系）的体外杀伤率（以样品1为例）
[0110] ?将两组CIK细胞与靶细胞（Hela细胞），按5 : 1、10 : 1、20 : 1、30 : 1比例 加入96孔培养板，同时设靶细胞组、效应细胞组和空白组，每组设3个平行孔，置于37°C， 5%C02,培养箱培养
[0111] #24h后，每孔取出IOOyl上清，再加入20yl5mg/mLMTT，继续孵育4h，再加入 100y1 0? 04mol/LHCl酸化异丙醇
[0112] ?在酶联免疫检测仪上选择570nm波长测各孔OD值，取3个平每孔加入分析纯 DMSO150yl，振荡溶解 5min。
[0113] ?平行孔平均OD值计算结果：
[0114] 杀伤活性（％ )= 1 -（实验组OD值一效应组OD值/靶细胞组OD值）X100 %。
[0115] 由图2可知当效靶比为30 : 1时对肿瘤细胞的杀伤率可达到72. 13%。
[0116] 本发明在此基础上添加⑶28mAb、IL-Ia，⑶3mAb在⑶28mAb的协同作用下，其刺 激活性明显提高。IL-Ia能提高CIK细胞的杀瘤活性，但是IL-Ia单独不能增强杀伤瘤 细胞活性，只有和IFN-y、⑶3mAb和IL-2联合作用时才能增强细胞毒活性。
[0117] 综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可 以在本发明的技术指导思想之内可以轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发 明的范围之内。
【主权项】
1. 一种高效扩增CIK的方法，其特征在于，无菌采集健康人或患者外周血，生理盐水 等体积稀释后，用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，在CIK细胞诱导过程中，加入 CD3mAb、CD28mAb、IFN-y、IL-2、IL-I a，培养 13-16 天收获细胞，制备 CIK 细胞制剂。2. 根据权利要求1所述的高效扩增CIK的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 采集正常健康人或肿瘤患者外周血，经检测无污染后，等体积生理盐水稀释，利用 Ficoll淋巴细胞分离液将稀释外周血进行单个核细胞分离；分离得到的PBMC用无血清培 养基调整浓度至5 X IO5个/ml-9 X 10 5个/ml，制成PBMC细胞悬液； (2) 将步骤（1)的PBMC细胞悬液转移至T-175培养瓶中，总体积100ml，并添加⑶3mAb、 CD28mAb、IL-2 ; (3) 转天向培养体系中加入IFN-y和IL-I a，计为培养的第1天； (4) 培养第3天，细胞计数，补加IL-2,使IL-2终浓度与步骤（2)时的浓度一样； (5) 培养第5天，细胞计数，加入100mL淋巴细胞完全培养基，补加IL-2,使IL-2终浓 度与步骤（2)时的浓度一样； (6) 培养第7天，补加与原培养体系等体积的无血清培养基、CD3mAb、CD28mAb、IL-2,使 CD3mAb、CD28mAb、IL-2终浓度与步骤（2)时的浓度一样； (7) 每隔2天进行细胞计数并补加与原培养体系等体积的无血清培养基，并补加IL-2， 使IL-2终浓度与步骤（2)时的浓度一样，连续培养13-16天后，离心收获CIK细胞。3. 根据权利要求2所述的高效扩增CIK的方法，其特征在于，所述Ficoll淋巴细胞分 离液密度为l.〇77g/ml。4. 根据权利要求2所述的高效扩增CIK的方法，其特征在于，所述步骤（2)和步骤（6) 中，⑶3mAb量在培养体系中终浓度为l-29ng/ml、⑶28mAb终浓度为50-99ng/ml。5. 根据权利要求2所述的高效扩增CIK的方法，其特征在于，所述步骤⑶中，添加入 培养体系中IFN-y的终浓度为701-999IU/ml。6. 根据权利要求2所述的高效扩增CIK的方法，其特征在于，所述步骤⑶中，添加入 培养体系中IL-I a的终浓度为51-99 y g/ml。7. 根据权利要求2所述的高效扩增CIK的方法，其特征在于，所述添加入培养体系中 IL-2 的终浓度为 500-999IU/ml。8. 根据权利要求2所述的高效扩增CIK的方法，其特征在于，所述培养第7天开始将细 胞培养液转移至培养袋中进行扩大培养。
【专利摘要】本发明公开了一种高效扩增CIK的方法，特别是体外利用细胞因子高效诱导外周血单个核细胞表达CD3及CD56的具有杀伤功能的细胞群,即细胞因子诱导的杀伤细胞。所述高效表达CD3+CD56的CIK培养方法包括以下步骤：无菌采集健康人或患者外周血，生理盐水等体积稀释后，用Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，在CIK细胞诱导过程中，加入CD3单克隆抗体(CD3mAb)、CD28单克隆抗体(CD28mAb)、干扰素-γ(IFN-γ)、白介素-2(IL-2)、白介素1α(IL-1α)，培养13-16天收获细胞，制备CIK细胞制剂，并进行流式细胞学检测和微生物学检测。本发明提供的CIK培养方法可以在两周的时间内将CIK数量提高到6×109以上、细胞成活率99％以上，其中CD3+CD56+细胞的双阳性比例达到30％以上。
【IPC分类】C12N5/0783
【公开号】CN105087487
【申请号】CN201510618219
【发明人】陈晓波, 洪敬欣, 韩洪起, 韩俊领, 武文杰, 靳霞, 苏相相, 郝世凯, 张宇光, 王雪莲
【申请人】协和干细胞基因工程有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年9月23日