5' 一GATCTTACGATTCTGCTGAGTCACTGTGACTGGATTCTGCTGAGTCACTGTGACTGGATT CTGCTGAGTCACTGTGACTGGGGTAC3'
[0033] 注：DNA合成由商业公司完成
[0034] (iii)将片段I和片段II分别溶解在超纯净水中配成100yM浓度的溶液；
[0035] (iv)将两种溶液等量混合，加热至95°C，然后缓慢冷却（1°C/min)至室温，产物即 为报告基因。
[0036](2)制备报告基因质粒
[0037](i)pGL4. 26[luc2/minP/Hygro]质粒由Promega公司购买（Madison,WI,USA)，将 质粒用KpnI和BglII内切酶切割后经凝胶电泳回收线性质粒；
[0038] (ii)将线性质粒与报告基因按5:1比例混合后用T4DNALigase链接酶进行连接 (22°C，3小时），得到报告基因质粒。
[0039] (3)用大肠杆菌将报告基因质粒扩增，提纯质粒
[0040] (i)用连接好的报告基因质粒转化感受态大肠杆菌细胞（可选用市售的感受态 DH5a菌株）；
[0041] (ii)热休克法转化大肠杆菌，扩增大肠杆菌，提取纯化质粒，得到足够量的报告基 因质粒。
[0042] (4)用提纯的报告基因质粒转染HeLa细胞，筛选稳定表达细胞株
[0043] (i)HeLa细胞使用含10%血清的高糖DMEM培养基培养于普通细胞培养箱中（5% 0)2,37°(：饱和湿度环境）；
[0044] (ii)用LifeTechnologies公司（Carlsbad,CA,USA)购买的Lipofectamine2000 试剂按推荐流程用报告基因质粒转染细胞，6小时后更换新鲜培养基，继续培养48小时；
[0045] (iii)转染48小时后将细胞进行传代，以大约25%铺满的密度种于培养板中，用 含有400yg/ml*的hygromycinB的培养基连续培养6周，每5天更换一次含hygromycin B的培养基；稳定表达报告基因的细胞能在hygromycinB存在情况下生长，不能稳定表达 报告基因的细胞被hygromycinB杀死。
[0046]*注：hygromycinB的最佳浓度可由实验者根据实际情况进行调整
[0047](iv)挑取阳性细胞克隆：低倍光镜下寻找生长良好的细胞克隆（见附图2)，标记 好位置。去除培养基并用生理盐水冲洗细胞一次。分别将不同的细胞克隆用无菌的移液器 头挑出，置于12孔板内培养至铺满；
[0048] (V)将稳定细胞株继续传代培养，适量扩增后，保存于液氮中备用。
[0049] (5)用已知的Nrf2激活剂鉴定各细胞株的反应性
[0050] ⑴将稳定表达细胞株按3XIO4个细胞/孔的密度接种于96孔板中培养24小时 让其贴壁生长。将不同竖列的细胞分为对照组和药物处理组。药物处理可选用已知的Nrf2 激活剂，例如Sulforaphane(浓度IuM);或Tert-butylhydroquinone(浓度 50uM)。对 照组用相应浓度的DMSO(药物溶剂）处理。培养24小时后进行Luciferase活性检测（见 下）；
[0051] (ii)选用反应性良好的细胞系（例如以上药物诱导的Luciferase活性与对照相 比增加2倍以上）进行后续筛选实验。
[0052] (7)选用反应性良好的细胞株用于未知化合物的筛选
[0053] (i)每一种实验条件可做4个副孔，即96孔板的4个孔对应一种实验条件；
[0054] (ii)将细胞按3XIO4个细胞/孔的密度接种于96孔板中培养24小时，加入待测 化合物后继续培养，相应设立溶剂对照组，24小时后进行Luciferase活性检测；
[0055] (iii)评估处理后每孔中剩余活细胞数量：选用Promega,公司（Madison,WI,USA) 的CellTiter96Aqueous试剂盒检测（货号G3580,G3581或G3582均可），按说明书的标 准步骤进行，记录吸光度数值（需要减去背景吸光度值，参见试剂盒说明书）。
[0056] (iv) Luciferase活性检测：选用Promega公司的Luciferase Assay试剂盒（货 号E1500)进行检测。检测前吸净培养板孔中由上一步残留的液体，后续按试剂盒说明书的 标准步骤进行，记录每孔的化学发光强度数值。
[0057] (V)数据的标准化处理：将步骤（iv)所得发光强度数值除以步骤（iii)所得的吸 光度数值，所得比值即为标准化后的Luciferase活性参数。
[0058] (vi)注意事项：如处理后剩余活细胞数量（吸光度数值）减少50%以上，说明化 合物对细胞毒性作用较强，应适当降低浓度。
[0059] 上述虽然结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行了描述，但并非对本发明保护 范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员 不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
【主权项】
1. 一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法，其特征是，步骤如下： (1) 构建含有3个Nrf2结合位点的报告基因； (2) 将报告基因插入到质粒当中，得到报告基因质粒； (3) 用大肠杆菌将报告基因质粒扩增并提纯质粒； (4) 用提纯的报告基因质粒转染HeLa细胞，筛选稳定表达细胞株用于未知化合物的筛 选。2. 如权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（1)具体如下： ⑴合成单链DNA片段I，序列如SEQ ID No. 1和单链DNA片段II，序列如SEQ ID No. 2， (2) 将片段I和片段II分别溶解在超纯净水中配成100 y M浓度的溶液； (3) 将两种溶液等量混合，加热至95°C，然后冷却至室温，产物即为报告基因。3. 如权利要求2所述的方法，其特征是，所述步骤（3)中以1°C /min冷却至室温。4. 如权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（2)将线性质粒与报告基因按5:1比 例混合。5. 如权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（3)用感受态DH5 a菌株将报告基因 质粒扩增并提纯质粒。6. 如权利要求1所述的方法，其特征是，所述步骤（4)中还包括选取药物 Sulforaphane或Tert-butylhydroquinone诱导的Luciferase活性与相应浓度的药物溶剂 处理相比增加2倍以上的细胞株。7. 如权利要求6所述的方法，其特征是，所述溶剂为DMS0。8. 如权利要求1-7任一所述的方法在新药研发中的应用。9. 如权利要求1-7任一所述的方法筛选得到的化合物。10. 如权利要求9所述的化合物在制备具有Nrf2激活活性药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种高通量筛选具有Nrf2激活活性的化合物的方法，包括以下步骤：(1)构建含有3个Nrf2结合位点的报告基因；(2)将报告基因插入到质粒当中，得到报告基因质粒；(3)用大肠杆菌将报告基因质粒扩增并提纯质粒；(4)用提纯的报告基因质粒转染HeLa细胞，筛选稳定表达细胞株用于未知化合物的筛选。本发明使现有技术中的检测Nrf2激活作用的方法能够适应新药前期开发阶段高通量筛选的需求。原有方法完成一次检测通常需要半天到两天不等，而一次实验所能检测的样品数量不超过十几个。本发明的方法，每个96孔板可检测至少10个样品，完成一个96孔板检测的时间少于30分钟。
【IPC分类】C12Q1/02, C12N15/85, C12N5/10
【公开号】CN105087644
【申请号】CN201510438707
【发明人】蒋凡, 叶青, 仵霄
【申请人】山东大学
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年7月23日