型的N构型，降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于LNA与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA、RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。与其他寡核苷酸类似物相比，DNA/LNA嵌合式寡核苷酸对单碱基变异具有良好的识别能力，以DNA/LNA嵌合引物或探针形式广泛应用于多种分子生物学检测技术中。
[0015]数字化PCR(digital PCR)是允许扩增来自最小稀释样品单一核酸模板的技术，或者说，是一种基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量方法，是一种绝对定量的方法。该技术的基本前提是采用分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至包括微滴或微反应孔在内的微反应器中，每个微反应器中的核酸模板数少于或等于I个。这样，经过PCR循环后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的微反应器就没有荧光信号。根据相对比例和微反应器的体积，就可推算出原始溶液的核酸浓度。与传统定量PCR的不同之处在于，数字化PCR通过直接计数的方法，可以实现起始核酸模板的绝对定量。此外，数字化PCR还可以是一种可以在大量野生型核酸模板背景中鉴定出微量突变体的方法。由于数字化PCR技术可将核酸模板用事先分隔开来的微反应器进行单分子水平的单独扩增，这样，就避免了高丰度基因型核酸模板对低丰度基因型核酸模板的扩增抑制，因此，可极大地提高痕量基因型的检出效率，例如，乳滴数字化PCR技术能够检测到低到0.001%的突变型基因，而核酸测序及常规实时荧光定量PCR法对少于I %的突变检出率是无能为力的，因此，数字化PCR的检测灵敏度至少可提高1000倍。数字化恒温扩增的基本原理与数字化PCR相似，均是通过已有的数字化制备系统，如美国伯乐公司的QX-100和QX-200、美国RainDrop公司的RainDance设备，制备适用于数字化恒温扩增的微反应器，然后采用恒温扩增技术扩增和检测靶分子。相对于数字化PCR，数字化恒温扩增的优势在于该技术仅仅采用单一的扩增温度，其扩增效率更高，特异性也更好。
[0016]由上可见，如果有效整合缺口酶、具有链置换活性DNA聚合酶和荧光标记DNA/LNA嵌合引物、数字化恒温扩增的协同作用优势，就能够在较高单一恒定温度条件下通过“切割-延伸-链置换”自主链式循环实现靶分子的数字化恒温指数扩增，并根据引物释放的荧光种类和丰度实现单个检测单元同时检测多种miRNA，有效解决miRNA现有技术瓶颈，实现miRNA的床旁快速检测。
【发明内容】
[0017]本发明要解决的技术问题提供一种基于寡核苷酸引物的数字化恒温扩增系统，该系统可在恒定温度条件下，能够在较高单一恒定温度条件下通过“切割-延伸-链置换”自主链式循环实现靶分子的恒温指数扩增的数字化恒温扩增与检测方法。
[0018]为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案:
[0019]微小RNA的数字化恒温检测方法，包括反应混合物，反应混合物包括以下反应成分:
[0020]①具有3’ -端羟基的miRNA靶分子；
[0021]②上游引物和下游引物；
[0022]③DNA聚合酶；
[0023]④识别上游引物和下游引物缺口剂识别序列的缺口剂；
[0024]⑤三磷酸脱氧核苷酸；
[0025]⑥满足上述DNA聚合酶和缺口剂生物学活性的离子与缓冲体系；
[0026]采用微流控或微滴化方法，将上述反应液分散至包括微滴或微反应孔在内的若干个微反应器中，每个微反应器中的每种靶分子数少于或等于I个；
[0027]所述反应混合物于恒温条件下反应；
[0028]所述的上游引物和下游引物是含有缺口剂识别序列的正义链序列，且其5’ 一 3’碱基均依次为锚定序列区、特异性识别miRNA靶分子序列的识别序列区；上游引物和下游引物的锚定序列区与miRNA靶分子无同源性，上游引物、下游引物的识别序列区分别与miRNA靶分子及miRNA靶分子互补链的3’ -端序列互补；
[0029]且单个微反应器中包括多种miRNA靶分子，但每种靶分子的数量少于或等于一个，与每种miRNA靶分子相对应的上游引物和下游引物还同时标记有荧光报告基团和淬灭基团，荧光报告基团和淬灭基团分别位于缺口剂识别序列的两侧，上游引物、下游引物均为寡核苷酸；
[0030]或者，与每种miRNA靶分子相对应的上游引物、下游引物中的其中一个标记有荧光报告基团和淬灭基团，且荧光报告基团和淬灭基团分别位于缺口剂识别序列的两侧，且上游引物、下游引物均为寡核苷酸；
[0031]多种miRNA靶分子中每种miRNA靶分子相对应的上游引物、下游引物标记的荧光报告基团种类不同。或者，多种miRNA靶分子中部分不同的miRNA靶分子相对应的上游引物、下游引物标记的荧光报告基团种类相同，但在引物丰度在反应混合物或每个微反应器中的浓度不同。
[0032]采用本发明技术方案的微小RNA的数字化恒温检测方法，缺口剂(nickingagent, NA)被用于识别和切割上游引物、下游引物缺口剂识别序列(nicking agentrecognit1n sequences, NARS)。当引物的缺口剂识别序列是缺口内切酶识别序列(nicking endonuclease recognit1n sequences, NERS)时，所用缺口剂是识别该缺口内切酶识别序列的缺口内切酶(nicking endonuclease, NE);当引物的缺口剂识别序列是半修饰限制性内切酶识别序列(restrict1n endonuclease recognit1n sequences, RERS)时，所用缺口剂是识别该半修饰RERS的限制性内切酶(restrict1n endonuclease, RE)；在反应混合物中，待检测物是含有在本发明中的miRNA靶分子的各种生物样本。
[0033]三磷酸脱氧核苷酸，通常包括dCTP、dGTP、dTTP或dATP，在生物DNA合成，以及引物介导的链延伸反应中起原料作用。
[0034]本发明的工作原理及有益效果为:上游引物和下游引物是含有缺口剂识别序列的正义链序列，且其5’ 一3’碱基依次为锚定序列区、特异性识别miRNA靶分子序列的识别序列区。上游引物Pl和下游引物P2的识别序列区分别与miRNA靶分子和miRNA靶分子互补链(即:miRNA*)的3’ -端序列互补，因此，上游引物和下游引物可分别识别miRNA靶分子或者miRNA靶分子互补链，并具有单碱基变异识别能力；锚定序列区的序列与miRNA靶分子无同源性，不能与miRNA靶分子或miRNA靶分子互补链产生非特异性杂交。在扩增过程中，上游引物Pl和下游引物P2锚定序列区可分别与miRNA靶分子和miRNA靶分子互补链的3’ -端延伸产物形成稳定的杂交双链，从而使上游引物Pl和下游引物P2能够分别“锚定”在miRNA靶分子和miRNA靶分子互补链的3’ -端延伸产物端，并且，该“锚定”能够在引物的锚定序列区形成缺口剂识别序列双链核酸分子，从而使缺口剂能够在引物的缺口剂识别序列正义链切割引物，并在DNA聚合酶的协同作用下，不断生成新生DNA链，DNA聚合酶通常是指RNA依赖型DNA聚合酶。因此，当上游引物和下游引物的识别序列区分别识别miRNA靶分子和miRNA靶分子互补链并形成杂交双链后，在DNA聚合酶的作用下，上游引物、下游引物、miRNA靶分子、miRNA靶分子互补链均产生5’ 一3’方向链延伸，并在上游引物与miRNA靶分子、下游引物与miRNA靶分子互补链之间分别形成两种完整的双链核酸分子，然后，缺口剂在缺口剂识别序列正义链序列处切割上游引物和下游引物。此时，上游引物和下游引物在DNA聚合酶的作用下，分别在缺口处延伸出新生DNA链，该新生DNA链与原有的miRNA靶分子或miRNA靶分子互补链分别互补，即新的miRNA靶分子或miRNA靶分子互补链。这些新的miRNA靶分子或miRNA靶分子互补链在缺口剂和DNA聚合酶的协同作用下不断从缺口处切割-延伸-链置换过程中扩增形成的双链核酸分子中置换出来，触发新一轮的上游引物和下游引物的上述反应，如此循环，实现miRNA靶分子在恒温条件下的指数扩增。在上述过程中，上游引物、下游引物的锚定序列区则因其“锚定”作用而使上述过程能够持续发生。
[0035]在本发明中，含有多种miRNA靶分子的反应混合液被分散至包括微滴或微反应孔在内的若干个微反应器中，每个微反应器可以有多种革G分子，但是，每个微反应器中的每种靶分子的数量或拷贝数是少于或等于I个。由于多个种类中的每种miRNA靶分子对应的上游引物和/或下游引物的上分别标记有荧光报告基团，且荧光报告基团的种类不同。当微反应器中的反应混合液中仅存在上游引物和下游引物时，其锚定序列区的荧光报告基团和淬灭基团因FRET作用使各引物均不产生荧光信号；当上游引物、下游引物与miRNA靶分子同时存在时，上游引物、下游引物、miRNA靶分子及其所产生的miRNA靶分子互补链均能在DNA聚合酶的作用下形成完整的双链核酸分子，从而使切口剂能够切割上游和/或下游引物销定序列区的缺口剂识别序列正义链，此时，销定序列区焚光报告基团和洋灭基团失去了 FRET作用，从而使引物标记的荧光报告基团释放荧光信号，并且，上游引物和/或下游引物的每一次延伸或扩增均能导致新的上游引物和下游引物释放荧光信号。因此，当若干个微反应器中存在多种miRNA靶分子，且与每种miRNA靶分子相对应的上游引物和/或下游引物还标记有荧光报告基团，那么则可实现在单个微反应器中通过反应混合中释放的荧光信号种类确定每个微反应器中是否存在靶分子，并最终通过微反应器释放靶种特定种类荧光信号的数量实现特定miRNA靶分子的绝对定量。
[0036]或者，在另一种情况下，为了进一步提高本发明所述方法的检测通量，不同的miRNA靶分子相对应的上游引物和/或下游引物标记的荧光报告基团种类相同，或者，同时使用标记了两种或两种以上不同种类的荧光报告基团，但在不同miRNA靶分子所对应的引物浓度，或者，同种miRNA靶分子标记了不同荧光报告基团所对应的引物浓度在反应混合物或每个微反应器中的浓度不同。在此条件下，在恒温扩增结束后，可根据少数几种不同荧光信号的种类和相对丰度，实现多种miRNA靶分子的平行检测。
[0037]进一步，所述的每种miRNA靶分子相对应的上游引物、下游引物中的荧光报告基团和淬灭基团至少设有两种；
[0038]所述的标记有荧光基团和淬灭基团的上游引物、下游引物之间的比例为I?5:1 ?5ο
[0039]进一步，所述的微反应器采用现有的微流控或微滴化方法制备，每个微反应器的反应液体积可为nL或pL级或fL级。
[0040]进一步，所述多个种类的miRNA靶分子相对应的上游引物和/或下游引物的锚定序列区和/或识别序列区掺入衍生核苷酸，衍生核苷酸包括锁核酸、肽核酸或硫代修饰碱基，以进一步提高引物的Tm值和/或特异性。
[0041]进一步，所述多个种类的miRNA靶分子相对应的上游引物和/或下游引物的识别序列区中含有与miRNA靶分子互补序列3’ -末端倒数第二位和/或第三位碱基错配的核苷酸，以进一步提尚识别序列区的特异性；
[0042]或者，在所述反应混合物中加入可抑制非特异性扩增的生物活性分子，包括TaqMutS、RecA0
[0043]进一步，所述的DNA聚合酶是具有链置换活性的DNA聚合酶；或者所述的DNA聚合酶不具有链置换活性，且在所述反应混合物中加入具有链置换活性的生物活性分子。
[0044]进一步，所述的荧光报告基团包括羧基荧光素、六氯荧光素、四氯荧光素、J0E、VIC、异硫氰酸荧光素、吲哚二羧菁、TAMRA或ROX ;所述的淬灭基团包括荧光类淬灭剂和非荧光类淬灭剂。
[0045]进一步，所述的恒温的反应温度范围为16_70°C。
[0046]进一步，所述的恒温的反应温度为37°C、55°C、60°C或65°C。
[0047]进一步，所述的反应时间为5_80min。
[0048]进一步，所述的反应时间为10min、20min、