区、特异性识别miR-189 (SEQ N0.22)及其互补链(SEQ N0.23)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子miR-189(SEQ N0.22)及其互补链(SEQ N0.23)的3’-末端序列互补，并在识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA ;序列中带有+号的碱基)。上游引物有两条，分别是在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子FAM和淬灭分子BHQl的SEQ N0.19，以及在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端焚光报告分子VIC和淬灭分子BHQl的SEQ N0.21。除SEQ N0.23之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
[0162]上游引物SEQ N0.19(5’ 一 3’ 方向)
[0163](FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)AC+TG+A+T+ATCAGC
[0164]上游引物SEQ N0.20(5，— 3’ 方向)
[0165](VIC)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)AC+TG+A+T+ATCAGC
[0166]下游引物SEQ N0.21 (5，—3’ 方向)
[0167]CCGATCTAGTGAGTCtgttcttTG+C+CT+A+C+TGAG
[0168]miRNA 革巴分子 SEQ N0.22 (5，— 3’ 方向)
[0169]UGCCUACUGAGCUGAUAUCAGU
[0170]miRNA革巴分子互补链SEQ N0.23 (5，— 3’方向)
[0171]ACTGATATCAGCTCAGTAGGCA。
[0172]6.miR-451靶分子特异性引物的设计与合成
[0173]SEQ N0.24和SEQ N0.25是扩增miRNA靶分子miR-451的上游引物，并且，二者序列相同；SEQ N0.26是扩增miRNA靶分子miR-451的下游引物。上游引物和下游引物5’ 一3’方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口内切酶NERS正义链序列(即:5，-GAGTC-3，)的锚定序列区、特异性识别miR-451 (SEQ N0.27)及其互补链(SEQ N0.28)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子miR-451(SEQ N0.27)及其互补链(SEQ N0.28)的3’-末端序列互补，并在识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA ;序列中带有+号的碱基)。上游引物有两条，分别是在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子FAM和淬灭分子BHQl的SEQ N0.24，以及在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端焚光报告分子VIC和淬灭分子BHQl的SEQ N0.25。除SEQ N0.23之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
[0174]上游引物SEQ N0.24(5’ 一 3’ 方向)
[0175](FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)A+ACT+C+A+G+T+A+AT
[0176]上游引物SEQ N0.25(5’ 一 3’ 方向)
[0177](VIC)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)A+ACT+C+A+G+T+A+AT
[0178]下游引物SEQ N0.26(5’ 一 3’ 方向)
[0179]CCGATCTAGTGAGTCtgttctt+A+A+ACCGT+T+ACCA
[0180]miRNA 革巴分子 SEQ N0.27 (5，— 3’ 方向)
[0181]AAACCGUUACCAUUACUGAGUU
[0182]miRNA革巴分子互补链SEQ N0.28 (5，— 3’方向)
[0183]AACTCAGTAATGGTAACGGTTT。
[0184]7.血清总RNA的提取
[0185]采用商品化总RNA提取试剂盒提取20例人体外周血血清总RNA。
[0186]8.数字化恒温指数扩增体系的构建
[0187]反应体系共计50yL，该体系包括以下组分:100mM NaCl、50mM Tris-HClUOmMMgCl2^ 100 μ g/ml BSA、0.05 单位 VentR (exo_) DNA 聚合酶(NEB)、1.6 单位 Nt.BstNBI 缺 P酶(ΝΕΒ)、600 μΜ dNTPs (Promega)、120ηΜ SEQ N0.U120nM SEQ Νο.2、120ηΜ SEQ N0.5、120ηΜ SEQ N0.6、120ηΜ SEQ N0.9、120ηΜ SEQ N0.10、60ηΜ SEQ N0.11、120ηΜ SEQ N0.14、120nM SEQ N0.15、120nM SEQ N0.16、60nM SEQ N0.19、60nM SEQ N0.20、120nM SEQ N0.21、60nM SEQ N0.24、120nM SEQ N0.25、120nM SEQ N0.26、miRNA 靶分子。其中，miRNA 靶分子分别来自于 1amol let_7a(SEQ N0.3)、10amol miR_105(SEQ N0.5)、10amol miR_26a(SEQN0.12)、10amol miR-16(SEQ N0.17)、1amol miR-189(SEQ N0.22)、1amol miR_451(SEQN0.22)、包括 let-7、miR-105、miR-26a、miR-16、miR-189、miR-451 等六种靶分子各 1amol的混合液、20例人体外周血血清总RNA待共计四种待检测样本。
[0188]9.微反应器的制备
[0189]采用商品化RainDrop公司的RainDance微滴制备器，将第4步制备的50 μ L反应液分散至200万个“油包液滴”形式的微反应器中，每个微反应器中的靶反应器中的同种miRNA数量或拷贝数是少于或等于一个。
[0190]10.靶分子的扩增与荧光检测
[0191]将第9步制备的“油包液滴”形式的微反应器所在反应管置于热循环仪上扩增，600C 30分钟，反应完毕后，采用商品化RainDrop公司的RainDance微滴检测器，检测FAM和VIC通道阳性的微反应器，并根据其阳性数值实现靶分子的绝对定量检测。
[0192]11.结果与分析
[0193]11.1多重数字化恒温扩增检测原理:现有的数字化核酸扩增检测系统均只有两色荧光通道(如:FAM和VIC)，如果单纯地只针对某种基因型标记一种荧光分子的话，会大大降低其检测效率。在本实施例中，对若干个微反应器的荧光强度进行终点检测，即在扩增反应终止后再通过每个微反应器的荧光信号种类和强度判断其基因型，最后，再通过计数特定基因型的微反应器的数量来实现特定基因型的绝对定量。当微反应器中针对不同基因型、但标记了相同荧光报告分子的引物时，由于每个微反应器中的对应基因数量或拷贝数少于或等于一个，因此，只有与该基因匹配的桥式荧光探针对会释放荧光，并且，其荧光强度与其在微反应器，或者说初始反应体系中的浓度成正比，当不同基因的荧光标记引物所用浓度不同时，可通过微反应器所释放的荧光信号强度来判断是哪种基因。另外一种相似情况是，针对某种特定的基因同时使用标记了不同荧光信号、但核酸序列相同的荧光标记引物，在此条件下，可根据某种基因所对应的不同荧光的绝对强度和相对强度，实现不同基因的绝对定量。由上可见，在现有数字化扩增检测系统有限荧光通道的情况下，通过更改不同基因所对应的微反应器荧光标记引物的丰度，可实现多种靶分子的检测。本实施例提供了利用现有两色荧光通道数字化PCR检测系统实现6种靶分子的单管检测，极大地提高了现有数字化恒温扩增系统的检测效率。
[0194]11.2靶分子1amol let_7a(SEQ N0.3)的检测结果:检测结果表明，所有的微反应器均检测不到VIC荧光信号，并且，FAM荧光信号阳性的微反应器或微滴的荧光强度值均在4000左右，数量是6.28 X 16,其检测结果与模板的初始量6.23 X 16极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let_7a(SEQ N0.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
[0195]11.3靶分子1amol miR-105(SEQ N0.5)的检测结果:检测结果表明，所有的微反应器均检测不到FAM荧光信号，并且，VIC荧光信号阳性的微反应器或微滴的荧光强度值均在4000左右，数量是6.18X 106，其检测结果与模板的初始量6.23 X 16极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let_7a(SEQ N0.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
[0196]11.4靶分子1amol miR_26a(SEQ N0.12)的检测结果:检测结果表明，所有具有荧光信号的微反应器或微滴均同时具有FM和VIC荧光，且二者的荧光强度值分别在4000和2000左右，数量是6.13X 106，其检测结果与模板的初始量6.23 X 16极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let_7a(SEQ N0.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
[0197]11.5靶分子1amol miR_16(SEQ N0.17)的检测结果:检测结果表明，所有具有荧光信号的微反应器或微滴均同时具有FM和VIC荧光，且二者的荧光强度值分别在4000和4000左右，数量是6.31 X 106，其检测结果与模板的初始量6.23 X 16极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let_7a(SEQ N0.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
[0198]11.6靶分子1amol miR_189(SEQ N0.22)的检测结果:检测结果表明，所有具有荧光信号的微反应器或微滴均同时具有FM和VIC荧光，且二者的荧光强度值分别在2000和2000左右，数量是6.24X 106，其检测结果与模板的初始量6.23 X 16极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let_7a(SEQ N0.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
[0199]11.7靶分子1amol miR-451 (SEQ N0.22)的检测结果:检测结果表明，所有具有荧光信号的微反应器或微滴均同时具有FM和VIC荧光，且二者的荧光强度值分别在2000和4000左右，数量是6.33X 106，其检测结果与模板的初始量6.23 X 16极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let_7a(SEQ N0.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
[0200]11.8 革巴分子混合液(即:let-7、miR-105、miR_26a、miR-16、miR-189、miR-451等六种革巴分子各1amol)的检测结果(图3):根据反应体系中let_7、miR-105、miR_26a、miR-16,miR-189,miR-451等6种靶分子的荧光标记引物在反应体系中所使用的浓度，其荧光信号阳性的微反应器FAM和VIC通道荧光信号强度的理论比值应当依次是4:0、0:4、4:2、4:4、2:2、2:4。检测结果与上述理论值完全相符，如图3所示，可根据FAM和VIC的相对荧光强度，在单个反应体系中仅仅使用两种荧光标记，实现了 6种靶分子的同时检测，其检测结果与第11.2到11.7的检测结果一致，并且，FAM与VIC通道的相对荧光强度值亦与第11.2到11.7的检测结果一致。
[0201]11.9临床20例血清样本的检测结果表明，let-7、miR-105, miR_26a、miR-16,miR-189,miR-451等6种靶分子均为阳性，其定量结果分别界于3.18?4.56X 105、2.14?
3.62X 104、2.56 ?3.67X 103、1.25 ?5.67X 105、4.34 ?6.87X 104、3.23 ?5.87X 104。。
[0202]实施例三、同时检测两