种miRNA靶分子
[0203]1.let_7a靶分子特异性引物的设计与合成
[0204]SEQ N0.29和SEQ N0.30分别是扩增miRNA靶分子let_7a的上游引物和下游引物，5’ 一3’方向的共同序列特征依次是含有Nt.AlwI切口内切酶NERS正义链序列(即:5，-GGATC-3，)的锚定序列区、特异性识别let-7a(SEQ N0.3)及其互补链(SEQ N0.4)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子let-7a(SEQN0.3)及其互补链(SEQ N0.4)的3’-末端序列互补。上游引物在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端焚光报告分子FAM和淬灭分子BHQl。除SEQ N0.4之夕卜，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
[0205]上游引物SEQ N0.29(5’ 一 3’ 方向)
[0206](FAM)CCGATCTAGTGGATCtgtt(BHQl)cttAACTATACAACC
[0207]下游引物SEQ N0.30(5，— 3’ 方向)
[0208]CCGATCTAGTGGATCtgttcttTGAGGTAGTAGG
[0209]miRNA 靶分子 SEQ N0.3 (5，一 3’ 方向)
[0210]UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
[0211]miRNA 靶分子互补链 SEQ N0.4(5，— 3’ 方向)
[0212]AACTATACAACCTACTACCTCA。
[0213]2.miR-105靶分子特异性引物的设计与合成
[0214]SEQ N0.31和SEQ N0.32分别是扩增miRNA靶分子miR-105的上游引物和下游引物，5’ 一3’方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口内切酶NERS正义链序列(即:5，-GGATC-3，)的锚定序列区、特异性识别miR-105 (SEQ N0.7)及其互补链(SEQ N0.8)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子miR-105(SEQN0.7)及其互补链(SEQ N0.8)的3’-末端序列互补，并在识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA ;序列中带有+号的碱基)。下游引物在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端焚光报告分子VIC和淬灭分子BHQl。除SEQ N0.8之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
[0215]上游引物SEQ N0.31 (5，—3’ 方向)
[0216]CCGATCTAGTGGATCtgttcttACCACAGGAG
[0217]下游引物SEQ N0.32 (5，—3’ 方向)
[0218](VIC)CCGATCTAGTGAGTCtgttcttTCAAAT(BHQl)GC+TCA
[0219]miRNA 革巴分子 SEQ N0.7 (5，— 3’ 方向)
[0220]UCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGU
[0221]miRNA革巴分子互补链SEQ N0.8 (5，— 3’方向)
[0222]ACCACAGGAGTCTGAGCATTTGA。
[0223]3.血清总RNA的提取
[0224]采用商品化总RNA提取试剂盒提取20例人体外周血血清总RNA。
[0225]4.数字化恒温指数扩增体系的构建
[0226]反应体系共计50yL，该体系包括以下组分:100mM NaCl、50mM Tris-HClUOmMMgC12、100 yg/ml BSA、0.05 单位 VentR(exo_)DNA 聚合酶(NEB)、1.6 单位 Nt.AlwI 缺 P酶(NEB)、50nM SEQ N0.29、50nM SEQ N0.30、50nM SEQ N0.31、50nM SEQ N0.32、400 μ MdNTPs (Promega)、miRNA革巴分子。其中，miRNA革巴分子分别来自于 1amol let_7a(SEQ N0.3)、1amol miR-105 (SEQ N0.5)、1amol let_7a 和 miR-105 混合液、20 例人体外周血血清总RNA待共计四种待检测样本。
[0227]5.微反应器的制备
[0228]采用商品化RainDrop公司的RainDance微滴制备器，将第4步制备的50 μ L反应液分散至200万个“油包液滴”形式的微反应器中，每个微反应器中的靶反应器中的同种miRNA数量或拷贝数是少于或等于一个。
[0229]6.靶分子的扩增与荧光检测
[0230]将第5步制备的“油包液滴”形式的微反应器所在反应管置于热循环仪上扩增，370C 30分钟，反应完毕后，采用商品化RainDrop公司的RainDance微滴检测器，检测FAM和VIC通道阳性的微反应器，并根据其阳性数值实现靶分子的绝对定量检测。
[0231]7.结果与分析
[0232]4.1靶分子1amol let_7a(SEQ N0.3)的检测结果:检测结果表明，所有的微反应器均检测不到VIC荧光信号，说明待检测样本中不存在miR-105靶分子。并且，FAM荧光信号阳性的微反应器或微滴的数量是6.28X 106，其检测结果与模板的初始量6.23X 106极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let_7a(SEQ N0.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
[0233]4.2靶分子1amol miR-105 (SEQ N0.5)的检测结果:检测结果表明，所有的微反应器均检测不到FAM荧光信号，说明待检测样本中不存在let-7a靶分子。并且，VIC荧光信号阳性的微反应器或微滴的数量是6.18X 106，其检测结果与模板的初始量6.23X 106极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let_7a(SEQ N0.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
[0234]4.3 革巴分子 1amol miR-105 (SEQ N0.5)和 1amol miR-105 (SEQ N0.7)混合物的检测结果:检测结果表明，FAM荧光信号阳性的微反应器或微滴的数量是6.28 X 16, VIC荧光信号阳性的微反应器或微滴的数量是6.18X106，其检测结果分别与第4.1和4.2步分别检测let-7a和miR-105的检测结果一致，并且，约30%的微反应器同时有FAM和VIC荧光信号，说明在此部分反应器中，同时有单拷贝的两种靶分子存在。
[0235]4.4临床20例血清样本的检测结果表明，let_7a和miR-105均为阳性，其定量结果分别界于 3.18 ?4.56X 15及 2.14 ?3.62X 10 4。
[0236]对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
【主权项】
1.微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于:包括反应混合物， 反应混合物包括以下反应成分: ①具有3’-端羟基的miRNA靶分子； ②上游引物和下游引物； ③DNA聚合酶； ④识别上游引物和下游引物缺口剂识别序列的缺口剂； ⑤三磷酸脱氧核苷酸； ⑥满足上述DNA聚合酶和缺口剂生物学活性的离子与缓冲体系； 采用微流控或微滴化方法，将上述反应混合物分散至包括微滴或微反应孔在内的若干个微反应器中，每个微反应器中的每种靶分子数少于或等于I个； 所述反应混合物于恒温条件下反应； 所述的上游引物和下游引物是含有缺口剂识别序列的正义链序列，且其5’ 一3’碱基均依次为锚定序列区、特异性识别miRNA靶分子序列的识别序列区；上游引物和下游引物的锚定序列区与miRNA靶分子无同源性，上游引物、下游引物的识别序列区分别与miRNA靶分子及miRNA靶分子互补链的3’ -端序列互补； 且单个微反应器中包括有多个种类的miRNA靶分子，与每种miRNA靶分子相对应的上游引物和下游引物还同时标记有荧光报告基团和淬灭基团，荧光报告基团和淬灭基团分别位于缺口剂识别序列的两侧，上游引物、下游引物均为寡核苷酸； 或者，与每种miRNA靶分子相对应的上游引物、下游引物中的其中一个标记有荧光报告基团和淬灭基团，且荧光报告基团和淬灭基团分别位于缺口剂识别序列的两侧，且上游引物、下游引物均为寡核苷酸； 多种miRNA靶分子中每种miRNA靶分子相对应的上游引物、下游引物标记的荧光基团种类不同。2.如权利要求1所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于:所述的每种miRNA靶分子相对应的上游引物、下游引物中的荧光报告基团和淬灭基团至少设有两种； 所述的标记有荧光基团和淬灭基团的上游引物、下游引物之间的比例为I?5:1?5。3.如权利要求1所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于:所述的微反应器采用现有的微流控或微滴化方法制备，每个微反应器的反应液体积可为nL或pL级或fL级。4.如权利要求1所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于:所述多个种类的miRNA靶分子相对应的上游引物、下游引物的锚定序列区、识别序列区均引入衍生核苷酸，衍生核苷酸包括锁核酸、肽核酸或硫代修饰碱基。5.如权利要求1所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于:所述多个种类的miRNA靶分子相对应的上游引物和/或下游引物的识别序列区中含有与miRNA靶分子互补序列3’ -末端倒数第二位和/或第三位碱基错配的核苷酸； 或者，在所述反应混合物中加入可抑制非特异性扩增的生物活性分子，包括Taq MutS,RecA06.如权利要求1所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于:所述的DNA聚合酶是具有链置换活性的DNA聚合酶； 或者所述的DNA聚合酶不具有链置换活性，且在所述反应混合物中加入具有链置换活性的生物活性分子。7.如权利要求1所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于:所述的荧光报告基团包括羧基荧光素、六氯荧光素、四氯荧光素、JOE、VIC、异硫氰酸荧光素、吲哚二羧菁、TAMRA或ROX ;所述的淬灭基团包括荧光类淬灭剂和非荧光类淬灭剂。8.如权利要求1至7中任意一项所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于:所述的恒温的反应温度范围为16-70°C。9.如权利要求8所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于:所述的恒温的反应温度为 37°C、55°C、60°C 或 65 °C。10.如权利要求1至7中任意一项所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于:所述的反应时间为5-80min。11.如权利要求10所述的微小RNA的数字化恒温检测方法，其特征在于:所述的反应时间为 10min、20min、30min、40min、50min 或 60min。12.如权利要求1至7、9、11中任意一项所述的微小RNA数字化恒温检测方法的试剂与试剂盒。
【专利摘要】本发明公开了一种微小RNA靶分子的数字化恒温指数扩增与检测方法，利用微流控或微滴化方法将反应液分散至包括微滴或微反应孔在内的若干个微反应器中，在每个微反应器中使用了靶分子特异性上游引物和下游引物，其锚定序列区含有缺口剂识别序列正义链序列，识别序列区则分别与miRNA及其互补链的3’-末端序列互补，实现恒定温度条件下指数扩增miRNA，并最终通过释放不同种类和相对强度荧光信号的微反应器数量来实现单个反应体系中绝对定量检测多种微小RNA靶分子。本发明克服了miRNA固有属性对其扩增检测方法的设计难度，提供一种基于寡核苷酸引物的数字化恒温扩增系统，能够在较高单一恒定温度条件实现多种靶分子恒温指数扩增和绝对定量的方法。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN105112507
【申请号】CN201510458682
【发明人】黄庆, 府伟灵, 黄君富, 夏涵
【申请人】中国人民解放军第三军医大学第一附属医院
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年7月30日