M SEQ N0.2、50nM SEQ N0.5、50nM SEQ N0.6、400 μ MdNTPs (Promega)、miRNA革巴分子。其中，miRNA革巴分子分别来自于 1amol let_7a(SEQ N0.3)、1amol miR-105 (SEQ N0.5)、1amol let_7a 和 miR-105 混合液、20 例人体外周血血清总RNA等共计四种待检测样本。
[0105]5.微反应器的制备
[0106]采用商品化RainDrop公司的RainDance微滴制备器，将第4步制备的50 μ L反应液分散至200万个“油包液滴”形式的微反应器中，每个微反应器中的靶反应器中的同种miRNA数量或拷贝数是少于或等于一个。
[0107]6.靶分子的扩增与荧光检测
[0108]将第5步制备的“油包液滴”形式的微反应器所在反应管置于热循环仪上扩增，600C 60分钟，反应完毕后，采用商品化RainDrop公司的RainDance微滴检测器，检测FAM和VIC通道阳性的微反应器，并根据其阳性数值实现靶分子的绝对定量检测。
[0109]7.结果与分析
[0110]7.1数字化恒温扩增的检测原理:数字化恒温扩增是允许扩增来自最小稀释样品单一核酸模板的技术，或者说，是一种基于单分子恒温扩增方法来进行计数的核酸定量方法，是一种绝对定量的方法。该技术的基本前提是采用分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至包括微滴或微反应孔在内的微反应器中，每个微反应器中的核酸模板数少于或等于I个。这样，经过恒温扩增后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的微反应器就没有荧光信号。根据相对比例和微反应器的体积，就可推算出原始溶液的核酸浓度。与传统定量检测方法的不同之处在于，数字化恒温扩增检测通过直接计数的方法，可以实现起始核酸模板的绝对定量。
[0111]7.2靶分子1amol let_7a(SEQ N0.3)的检测结果:检测结果表明，所有的微反应器均检测不到VIC荧光信号，说明待检测样本中不存在miR-105靶分子。并且，FAM荧光信号阳性的微反应器或微滴的数量是6.28X 106，其检测结果与模板的初始量6.23X 106极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let_7a(SEQ N0.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
[0112]7.3靶分子1amol miR-105 (SEQ N0.5)的检测结果:检测结果表明，所有的微反应器均检测不到FAM荧光信号，说明待检测样本中不存在let-7a靶分子。并且，VIC荧光信号阳性的微反应器或微滴的数量是6.18X 106，其检测结果与模板的初始量6.23X 106极为接近，二者存在略微差异的原因在于人工合成的let_7a(SEQ N0.3)模板在其稀释过程中可能存在一些误差。
[0113]7.4 靶分子 1amol miR-105 (SEQ N0.5)和 1amol miR-105 (SEQ N0.5)混合物的检测结果:检测结果表明，FAM荧光信号阳性的微反应器或微滴的数量是6.28 X 16, VIC荧光信号阳性的微反应器或微滴的数量是6.18X106，其检测结果分别与第4.1和4.2步分别检测let-7a和miR-105的检测结果一致，并且，约30%的微反应器同时有FAM和VIC荧光信号，说明在此部分反应器中，同时有单拷贝的两种靶分子存在。
[0114]4.4临床20例血清样本的检测结果表明，let-7a和miR-105均为阳性，其定量结果分别界于 3.18 ?4.56X 15及 2.14 ?3.62X 10 4。
[0115]实施例二、数字化恒温扩增同时检测六种miRNA靶分子
[0116]1.let_7a靶分子特异性引物的设计与合成
[0117]SEQ N0.1和SEQ N0.2分别是扩增miRNA靶分子let_7a的上游引物和下游引物，5’ 一3’方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口内切酶NERS正义链序列(即:5，-GAGTC-3，)的锚定序列区、特异性识别let-7a(SEQ N0.3)及其互补链(SEQ N0.4)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子let-7a(SEQN0.3)及其互补链(SEQ N0.4)的3’-末端序列互补，并在识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA ;序列中带有+号的碱基)。上游引物的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有焚光报告分子FAM和淬灭分子BHQl。除SEQ N0.4之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
[0118]上游引物SEQ N0.1 (5，—3’ 方向)
[0119](FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)A+A+C+T+A+TA+CAACC
[0120]下游引物SEQ N0.2 (5，—3’ 方向)
[0121]CCGATCTAGTGAGTCtgttcttT+G+A+GGTAGTAGG
[0122]miRNA 革巴分子 SEQ N0.3 (5，— 3’ 方向)
[0123]UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUU
[0124]miRNA革巴分子互补链SEQ N0.4(5，— 3’方向)
[0125]AACTATACAACCTACTACCTCA。
[0126]2.miR-105靶分子特异性引物的设计与合成
[0127]SEQ N0.5和SEQ N0.6分别是扩增miRNA靶分子miR-105的上游引物和下游引物，5’ 一3’方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口内切酶NERS正义链序列(即:5，-GAGTC-3，)的锚定序列区、特异性识别miR-105 (SEQ N0.7)及其互补链(SEQ N0.8)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子miR-105(SEQN0.7)及其互补链(SEQ N0.8)的3’-末端序列互补，并在识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA ;序列中带有+号的碱基)。下游引物在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端焚光报告分子VIC和淬灭分子BHQl。除SEQ N0.8之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
[0128]上游引物SEQ N0.5(5’ 一 3’ 方向)
[0129](VIC)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)AC+CA+CAG+GAG
[0130]下游引物SEQ N0.6 (5，—3’ 方向)
[0131]CCGATCTAGTGAGTCtgttcttTC+AAAT+GC+TCA
[0132]miRNA 革巴分子 SEQ N0.7 (5，— 3’ 方向)
[0133]UCAAAUGCUCAGACUCCUGUGGU
[0134]miRNA革巴分子互补链SEQ N0.8 (5，— 3’方向)
[0135]ACCACAGGAGTCTGAGCATTTGA。
[0136]3.miR-26a靶分子特异性引物的设计与合成
[0137]SEQ N0.9是扩增miRNA革巴分子miR_26a的上游引物，SEQ N0.10和SEQ N0.11是扩增miRNA靶分子miR-26a的下游引物，并且，SEQ N0.10和SEQ N0.11的序列相同。上游引物和下游引物5’ 一3’方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口内切酶NERS正义链序列(即:5，-GAGTC-3，)的锚定序列区、特异性识别miR-26a(SEQ N0.12)及其互补链(SEQ N0.13)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子miR-26a(SEQ N0.12)及其互补链(SEQ N0.13)的3’-末端序列互补，并在识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA ;序列中带有+号的碱基)。下游引物有两条，分别是在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端焚光报告分子VIC和淬灭分子BHQl的SEQ N0.10，以及在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子VIC和淬灭分子BHQl的SEQ N0.11。除SEQ N0.13之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
[0138]上游引物SEQ N0.9(5’ 一 3’ 方向)
[0139]CCGATCTAGTGAGTCtgttcttAG+CC+TAT+CC+TG
[0140]下游引物SEQ N0.10(5，— 3’ 方向)
[0141](FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)TTC+A+AG+TA+ATC
[0142]下游引物SEQ N0.11 (5，—3’ 方向)
[0143](VIC)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)TTC+A+AG+TA+ATC
[0144]miRNA 靶分子 SEQ N0.12(5’ 一 3’ 方向)
[0145]UUCAA⑶AAUCCAGGAUAGGCU
[0146]miRNA 靶分子互补链 SEQ N0.13(5’ 一 3’ 方向)
[0147]AGCCTATCCTGGATTACTTGAA。
[0148]4.miR-16靶分子特异性引物的设计与合成
[0149]SEQ N0.14和SEQ N0.15是扩增miRNA靶分子miR-16的上游引物，并且，二者序列相同；SEQ N0.16是扩增miRNA靶分子miR-16的下游引物。上游引物和下游引物5’ 一 3’方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口内切酶NERS正义链序列(即:5，-GAGTC-3，)的锚定序列区、特异性识别miR-16(SEQ N0.17)及其互补链(SEQ N0.18)的识别序列区。其中，上游引物和下游引物的序列识别区分别与miRNA靶分子miR-16(SEQ N0.17)及其互补链(SEQ N0.18)的3’-末端序列互补，并在识别序列区的部分位置设计有锁核酸(LNA ;序列中带有+号的碱基)。上游引物有两条，分别是在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端荧光报告分子FAM和淬灭分子BHQl的SEQ N0.14，以及在锚定序列区所在的NERS正义链序列两侧的碱基分别标记有端焚光报告分子VIC和淬灭分子BHQl的SEQ N0.15。除SEQ N0.18之外，所有寡核苷酸分子由专业公司合成。
[0150]上游引物SEQ N0.14(5’ 一 3’ 方向)
[0151](FAM)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)CG+C+C+A+ATATTTA
[0152]上游引物SEQ N0.15(5’ 一 3’ 方向)
[0153](VIC)CCGATCTAGTGAGTCtgttctt(BHQl)CG+C+C+A+ATATTTA
[0154]下游引物SEQ N0.16(5’ 一 3’ 方向)
[0155]CCGATCTAGTGAGTCtgttcttTAGC+AG+CA+C+GTA
[0156]miRNA 靶分子 SEQ N0.17(5’ 一 3’ 方向)
[0157]UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG
[0158]miRNA 靶分子互补链 SEQ N0.18(5’ 一 3’ 方向)
[0159]CGCCAATATTTACGTGCTGCTA。
[0160]5.miR-189靶分子特异性引物的设计与合成
[0161]SEQ N0.19和SEQ N0.20是扩增miRNA靶分子miR-189的上游引物，并且，二者序列相同；SEQ N0.21是扩增miRNA靶分子miR-189的下游引物。上游引物和下游引物5’ 一3’方向的共同序列特征依次是含有Nt.BstNBI切口内切酶NERS正义链序列(即:5，-GAGTC-3，)的锚定序列