caatgcagaggagtacgacaatggatccaagaagcaaggtga tgctgatg 3' -SEQ ID cagtccttgc 3' -SEQ ID勵：11)从质粒口0?494扩增0?313编码序列并将其插入质粒 pcDNA3_NP，如 Geiser 所述。
[0120] 实施例2 -插入tPA信号肽
[0121] 使用寡核苷酸頂X1305(5' cactgagtgacatcaaaatcatgGATGCAATGAAGAGAGGGC3' -SEQ ID NO:12)和 IMX1306(5' cgtaagaccgtttggtgccttggctagctcttctgaatcgggcatggattt cc 3' -SEQ ID N0:13)从载体pSG2-85A(Spencer)扩增tPA信号肽并符合读框地插入多 个质粒中NP编码序列的N-末端，如Geiser所述。
[0122] 实施例3 -产生NP的两个点突变以使其成为单体的
[0123]使用寡核苷酸引物 IMX1287 (5' ccattctgccgcatttgCagatctaagag 3' - SEQ ID N0:14)和頂X1288(5'CAAAAGGGAGATTTGCCTGTACTGAGAAC 3' _SEQ ID N0:15)以扩增 NP 基 因的内部片段，并将所得的PCR产物插入NP-编码质粒，如Geiser所述。因为两个寡核苷酸 与NP基因不完美匹配，PCR产物的插入产生两个点突变。頂X1287引物产生突变E339A(GAA 至GCA)，而頂X1288引物在NP基因中产生突变R416A(AGA至GCA)。
[0124] 实施例4 -插入頂X313T
[0125]使用寡核苷酸引物頂X1289(SEQ ID N0:10)和頂X051(5'GTAGAAACAAGGGTAmTT CTTtattaggagcgacggcgacgc 3' -SEQ ID 勵：16)从质粒口0?497 扩增0?3131'编码序列 并插入多个pcDNA3-NP-来源的质粒，如Geiser所述。
[0126] 实施例5 -用根据本发明的核酸的DNA免疫
[0127] 5. 1.规程
[0128] 将多组五只雌性BALB/C小鼠用多个质粒DNA肌内免疫两次，间隔14天，每次注 射使用20 y g每个质粒。在第28天测量免疫响应以确定多个修饰的影响：+/-IMX313或 頂X313T ;+/-tPA信号肽；+/-单体化突变。
[0129] 抗原特异性T-细胞响应使用脾细胞在第28天通过ELISPOTs测量。将分离自免 疫的小鼠的纯化的脾⑶4+、⑶8+和总T细胞与购自Eurogentec的NP A流感肽（氨基酸 366-374)共培养。
[0130] ￡1^?01'测定法：将平底、96-孔硝化纤维素板收11^^6。1^111口〇代）用 IFN- y mAb (15 y g/ml ;MABTECH，Stockholm)涂覆并在4°C温育过夜。在用PBS洗涤后，将板 用10%胎牛血清在37°C封闭一小时。将每孔2xl0 6个细胞用相关肽以2 y g/ml的终浓度 (NP A流感肽）在用15 y g/ml抗-人IFN- y涂覆的膜上刺激并温育20小时。在温育后， 将板用PBS彻底洗涤以去除细胞，并将IFN- y mAb (1 y g/ml生物素，MABTECH)加至每孔。 在37°C温育2小时后，将板洗涤并用抗生蛋白链菌素-HRP(1 y g/ml ;MABTECH)在室温显色 (develop) 一小时。洗涤后，加入底物（3_氨基_9_乙基味唑（3-amin〇-9_ethycarbazol) (Sigma))并温育15分钟。在进一步洗涤后，在显微镜下计数红色斑点。
[0131] 为了研究体液免疫响应，我们通过特异于总IgG的ELISAs评价了抗体水平，以及 分别特异于IgGl和IgG2a的ELISAs以评价Thl和Th2的相对比例。BALB/c小鼠通常以 Th2-型免疫响应响应于流感疫苗，其与IgGl抗体的刺激相关。然而，病毒感染下存活的小 鼠血清中存在的主要抗体同种型是IgG2a，其在Thl-型免疫响应过程中被刺激（Huber)。 IgG2a抗体的刺激已与流感免疫接种的效力增加相关。
[0132] 对于ELISAs，将抗原稀释至5mg/ml的浓度于0. 1M碳酸钠/碳酸氢钠（pH 9. 6)然 后用于涂覆MaxiSorb板（Nunc-Immulon, Denmark)的孔。将两倍稀释的测试血清添加至孔， 并在洗涤后用缀合于辣根过氧化物酶的抗小鼠IgG2a、抗小鼠IgG或抗小鼠IgGl (Sigma)检 测结合的抗体。在添加邻苯二胺（Sigma)和H202后测定490nm的吸光度；用1M硫酸终止反 应。
[0133] 结果示于图2至5。
[0134] 5. 2.在初步实验中，我们测试了由编码NP或融合于頂X313的NP的DNA疫苗诱导 的对NP的总T细胞响应。分离自NP-頂X313免疫的小鼠的总T细胞显示与NP免疫的小鼠 的那些相比显著更高的IFNy响应，并确认頂X313增加T细胞响应的能力。
[0135] 图2显示亲本NP抗原基因融合于頂X313基因改进对于NP的T细胞响应，甚至是 当融合蛋白在细胞质中表达时。
[0136] 5.3.为了确定ELISPOTs中检测到的IFN-y是由⑶4还是由⑶8T细胞产生， 我们从免疫的小鼠纯化了脾⑶4+和⑶8+T细胞，且将这些与流感A NP肽共培养。在用 NP-頂X313免疫的组中检测到自⑶8+T细胞产生IFN-y的显著增加。产生IFN- y的抗原 特异性CD8+细胞的百分数高于相应的CD4+T的群体（图3)。
[0137] 图3显示NP抗原基因融合于頂X313基因改进了对于NP抗原的⑶4+和⑶8+响 应两者。
[0138] 5. 4.然后我们检查了免疫后以及末次免疫后14天对于NP的抗体响应，在血清中 测量了 NP-特异性IgG Ab响应。NP对照小鼠和给予NP-頂X313的小鼠显示中度NP-特异 性IgG Abs (图4)，其在用NP-頂X313免疫的组中更高。
[0139] 图4显示NP基因融合于頂X313基因改进对于NP抗原的IgG抗体响应。
[0140] 5. 5.还检查了血清中NP-特异性IgGl和IgG2a抗体的存在（分别为Balb/C小鼠 中Th2和Thl型响应的代表）。在NP-頂X313免疫的小鼠的血清中检测到NP-特异性IgGl 和IgG2a抗体同种型；然而，来自单独给予NP的小鼠的血清样本仅显示低水平的IgGl和 IgG2a Ab (图 5)。
[0141] 图5显示针对NP抗原诱导的抗体的亚类分布。融合于頂X313基因改进了 IgG2A 响应多于IgGl响应，将针对NP的Th2-偏好的响应转变为针对NP-頂X313的Thl-偏好的 响应。
[0142] 结果列于下表：
[0143]
[0144]表 1
[0145] 图6显示NP的单体化（NPm)轻微地改进其免疫原性（尽管所述改进不是统计学 上显著的：NS) ;NPm免疫原性进一步通过融合于頂X313基因而改进；且最终单体NP融合于 頂X313T基因进一步增强NP免疫原性。令人惊讶地，NP的单体化不降低其免疫原性。
[0146] 图7显示，对于⑶4+和⑶8+响应的分析，可见如图6中相同的排序（rank ordering) :NP的单体化轻微改进NP的免疫原性但不显著（NS) ;NP的免疫原性通过融合于 頂X313基因进一步改进，但是NP免疫原性的最大的改进通过将单体NP融合于頂X313T基 因而获得。
[0147] 图8显示对于B细胞响应可见对于T细胞响应（⑶4+和⑶8+两者）在图6和7 中所见的相同的排序。用頂X313T得到的针对NP的总IgG响应高于以頂X313得到的。
[0148] 图9显示由单体NP抗原诱导的抗体的亚类分布。对于NP，融合于頂X313基因使 IgG2A响应增强大于IgGl响应，将针对NP的Th2-偏好的响应（0. 8)转变为针对NP-IMX313 的Thl-偏好的响应（1.51)。Th2向Thl偏好的此反转由融合于頂X313T而非融合于 頂X313(l. 5)来维持。IgG2a抗体在流感疫苗中的表达与病毒的清除和针对致死性流感攻 击的增加的保护相关。如通过ELISA测量的两种抗体同种型的诱导增加对于疫苗功效比对 于单独中和更好地相关（Huber)。
[0149]
[0150] u
[0151] 实施例6-NP抗原的分泌改进其免疫原性
[0152] 制备一系列含有组织纤维蛋白溶酶原激活剂（tPA)分泌信号序列的NP DNA疫苗 构建体：tPA-NP、tPA-NPm、tPA-NPm-頂X313 和 tPA-NPm-頂X313T。分析了 tPA 融合于 NP 对 于来自免疫的动物的体液和细胞免疫响应的作用。
[0153] 用含有tPA的构建体免疫的小鼠显示与NP免疫的小鼠的那些相比显著更高的 IFN y响应，并确认IMX313T和单体化突变增加T细胞响应的能力。
[0154] 图10显示强制分泌NP抗原改进其免疫原性（NP对tPA-NP)，无论它是否是单体的 (tPA-NP对tPA-NPm)。然而，融合于頂X313显示使用单体形式的NP比使用未修饰的抗原 更具免疫原性（tPA-NP-頂X313对tPA-NPm-頂X313)。而且用頂X313T取代頂X313进一步 改进NP的免疫原性（tPA-NPm-頂X313对tPA-NPm-頂X313T)。
[0155] 图11显示对于不同的分泌形式的NP的⑶8+和⑶4+响应。可见与图10中相同的 排序，而且当添加頂X313时，单体化抗原的效用再次彰显。如前述附图中，当使用頂X313T 而非IMX313时可见最大的免疫响应。
[0156] 图12显示对于抗原NP的总IgG响应并招致与图11对于T细胞响应相同的结论： 当使用頂X313T时可见最大的响应，但分泌（NP对tPA-NP)和单体化（tPA-NP-頂X313对 tPA-NPm-頂X313)也是重要的贡献。
[0157] 单用NP (作为NP、tPA-NP或tPA-NPm)免疫的小鼠在它们的血清中不具有或具有 非常低水平的抗-NP IgG抗体（图12)。另一方面，用tPA-NP-頂X313、tPA-NPm-頂X313 或tPA-NPm-頂X313T免疫的小鼠显示高水平的系统性NP-特异性IgG抗体响应；再一次， tPA-NPm-頂X313T免疫的小鼠相比于所有其他组免疫的小鼠具有显著更高的（p〈0. 001) IgG抗体响应。这显示所有修饰（单体化突变、tPA和頂X313T)的组合赋予抗原相比于亲 本序列或其他组合显著改进的免疫原性。
[0158] 图13显示对于NP的B细胞响应的亚类分析，并说明了单用NP的初始Th2偏好通 过頂X313并通过頂X313T反转。虽然分泌对其自身（NP对tPA-NP)、单体化（tPA-NP-頂X313 对 tPA-NPm-頂X313)然后是用頂X313T 替代頂X313 (tPA-NPm-頂X313 对 tPA-NPm-頂X313T) 几乎不具有作用，所有均贡献于改进的Thl(IgG2a)相对于Th2(IgGl)响应。
[0159] 非常重要的是tPA-NPm-頂X313T对其自身几乎等同地改进Thl和Th2响应。NP融 合于頂X313显示Thl和Th2响应两者都增加，而且在响应类型上没有显著的转移。但是将 頂X313T与单体化突变组合，Thl响应（IgG2a)开始占主导。免疫学家们的共识是Thl响应 优选于Th2响应（图13)。
[0160] 这些结果在此制表：
[0161]
[0162]
[0163]表 3
[0164] 实施例7 -产生重组NPm-頂X313T蛋白
[0165] 表达A/WSN/33(Tarus 2012b)株的野生型H1N1NP蛋白的具有C-末端6-His-标 签的PET22-衍生的质粒在细菌菌株C43R中表达。此菌株通过用罕见密码子表达质粒 pRARE2 (Novagen)转化C43 (DE3)制得。表达在TB (Terrific培养液）培养基中用IPTG诱 导。过表达的蛋白如Ye所述初始纯化，并如Tarus所述用于澄清（clarification)和离子 交换步骤，但在最终步骤中通过在肝素琼脂糖凝胶（Heparin Sepharose)上通过亲和性并 通过凝胶过滤（Hi Pr印26/60S印hacryl S-300)纯化融合蛋白，如2013年12月11日提 交的专利申请PCT/EP2013/076289中所述。
[0166] 为了表达NPm-頂X313T蛋白，在两个步骤中修饰表达NP的质粒。第一，如实施例3 中使用寡核昔酸引物頂父1287(5'(^81:1：(^8(^8〇&1:1^8〇&8&1：(^&&8&83'-3￡( >)10繼：14)和 頂X1288(5'CAAAAGGGAGAITTGCCTGTACTGAGAAC 3' -SEQ ID N0:15)引入单体化突变。在 第二步中，使用如实施例4中相同的寡核苷酸引物以頂X313T编码序列替代6-His-标签： 頂X1289(SEQ ID N0:10)和頂X051(5' GTAGAAACAAGGGTATTTTTCTTtattaggagcgacggcgacgc 3' -SEQ ID N0:16)。然后插入PCR产物替代6-His-标签，如Geiser所述。
[0167] NPm-頂X313T融合蛋白以与NP蛋白相同的方式在相同的菌株中表达，并使用相同 的层析步骤纯化。
[0168] 实施例8-免疫
[0169] 然后进行小鼠的免疫以比较NPm-頂X313T(具有或不具有与AddaVax佐剂 (Invivogen)的配制物）的免疫原性。将NP蛋白（具有或不具有与AddaVax佐剂的配制 物）用作对照。
[0170] 为此，将4组（五只）雌性BALB/c小鼠皮下免疫两次，间隔14天，每次注射使 用20 y g的每种蛋白。使用脾细胞在第28天通过ELISPOTs测量抗原-特异性T-细胞 响应的诱导。将分离自免疫的小鼠的纯化的脾CD4+、CD8+和总T细胞与NP蛋白或流感A NP (366-374)肽共培养。以NP作为抗原通过ELISAs测量免疫前和第28天的抗体响应。
[0171] 实施例9