因子VIII与多种其它组分（例如LRP、多种受体、其它凝 血因子、细胞表面）的结合能力，引入和/或消除糖基化位点等。
[0028] 本发明的因子VIII分子具有因子VIII活性，意即以下能力：在凝血级联中以与 FVIII功能类似或等同的方式起作用，通过与被激活的血小板上的FIXa相互作用而诱导 FXa的形成，并支持血块的形成。该活性可通过本领域熟知的技术在体外评估，所述技术为 例如凝血分析、内源凝血酶潜在性分析等。本发明的因子VIII分子具有FVIII活性，其为天 然人FVIII活性的至少约10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、 至少80%、至少90%、和100%或甚至超过100%。
[0029]B结构域：_子VIII中的B结构域跨越SEQ ID NO 1的氨基酸741-1648。B结构 域在若干不同位点被切割，在循环血浆FVIII分子中产生大的异质性。高度糖基化的B结 构域的准确功能尚未知晓。已经知道的是该结构域对于凝血级联中的FVIII活性而言并非 必要。这种明显的功能缺乏得到以下事实支持结构域缺失的/截短的FVIII看来具有 与在全长天然FVIII中所见的相同的体内性能。话虽如此，据显示B结构域可减少与细胞 膜的缔合，至少在无血清条件下是如此。
[0030]B结构域截短的/缺失的闵子VIII分子：将内源全长FVIII合成为单链前体分子。 分泌之前，将前体切割成重链和轻链。可由2种不同策略产生重组B结构域缺失的FVIII。 将无B结构域的重链以及轻链分别合成为两种不同多肽链（两链策略）或者将B结构域缺 失的FVIII合成为单条前体多肽链（单链策略），其按照与全长FVIII前体相同的方式切割 为重链和轻链。
[0031] 在B结构域缺失的FVIII前体多肽中，重链和轻链部分通常被接头间隔开来。为 了尽量减小在B结构域缺失的FVIII中引入免疫原性表位的风险，接头序列优选源自FVIII B结构域。至少，接头必须包含蛋白酶识别位点，所述酶将B结构域缺失的FVIII前体多肽 分离为重链和轻链。在全长FVIII的B结构域中，氨基酸1644-1648构成该识别位点。在B 结构域缺失的FVIII激活时导致接头去除的凝血酶位点位于重链上。因此，接头的大小和 氨基酸序列不大可能影响其经由凝血酶激活而从剩余FVIII分子上切除。B结构域的缺失 对于FVIII的产生是有利的。然而，B结构域的部分可包括在接头中而不降低产率。B结构 域对产率的负面效应并不归因于B结构域的任何特定尺寸或序列。
[0032] 截短的B结构域可含有若干0-糖基化位点。然而，依据一个优选的实施方案，所 述分子在截短的B结构域中包含仅1个、备选2、3或4个0联寡糖。
[0033] 依据一个优选的实施方案，截短的B结构域包含仅1个可能的0-糖基化位点并且 侧链例如PEG或白蛋白结合剂与该0-糖基化位点共价缀合。
[0034] 可将在本发明的B结构域截短的分子中的0联寡糖连接到0-糖基化位点，所述位 点通过重组方式和/或通过经由B结构域截短而将"隐藏的"0-糖基化位点暴露而人工产 生。在这两种情况下，可通过设计B结构域截短的因子VIII的氨基酸序列并随后对所述氨 基酸序列进行计算机分析，预测截短的B结构域中0-糖基化位点的概率，从 而制备所述分子。可在合适宿主细胞中合成有相对高概率具有所述糖基化位点的分子，然 后分析糖基化模式并随后选择在截短的B结构域中具有0联糖基化的分子。
[0035] 所述因子VIII分子也含有大量N联寡糖并且它们每个都可同样作为用于连接疏 水性侧基的锚。
[0036] 用于产生本发明的重组因子VIII融合蛋白的合适宿主细胞优选是哺乳动物来源 的，以确保所述分子被糖基化。在实施本发明时，所述细胞是哺乳动物细胞，更优选已确立 的哺乳动物细胞系，包括但不限于CH0、C0S-1、幼仓鼠肾（BHK)和HEK293细胞系。其它合适 的细胞系包括但不限于大鼠H印I、大鼠H印II、TCMK、人肺、DUKX细胞（CH0细胞系）。还 可使用的是3T3细胞、Namalwa细胞、骨髓瘤和骨髓瘤与其它细胞的融合物。在某些实施方 案中，所述细胞可以是突变的或重组的细胞，例如与其所来源的细胞类型相比表达在质量 或数量上不同的酶谱的细胞，所述酶催化蛋白质的翻译后修饰（例如糖基化酶例如糖基转 移酶和/或糖苷酶，或加工酶例如前肽）。DUKX细胞（CH0细胞系）是特别优选的。
[0037] 目前优选的细胞是HEK293、C0S、中国仓鼠卵巢（CH0)细胞、幼仓鼠肾（BHK)和骨 髓瘤细胞，尤其是中国仓鼠卵巢（CH0)细胞。
[0038] 在wt FVIII分子中B结构域的长度为约908个氨基酸。在本发明分子中截短的 B结构域的长度可在约10-约800个氨基酸的范围内变化，例如约10个氨基酸-约700个 氨基酸，例如约12-500个氨基酸、12-400个氨基酸、12-300个氨基酸、12-200个氨基酸、 15-100个氨基酸、15-75个氨基酸、15-50个氨基酸、15-45个氨基酸、20-45个氨基酸、20-40 个氨基酸、或20-30个氨基酸。所述截短的B结构域可包含重链和/或轻链的片段和/或 wt FVIII分子中不存在的人工导入序列。术语"B结构域截短的"和"B结构域缺失的"在 本文中可互换使用。
[0039]改自的循环半衰期：与野牛铟闵子VIII分子相比，本发明的分子具有改变的循 环半衰期，优选增加的循环半衰期。循环半衰期优选增加至少10%，优选至少15%，优选至 少20%，优选至少25%，优选至少30%，优选至少35%，优选至少40%，优选至少45%，优选至 少50%，优选至少55%，优选至少60%，优选至少65%，优选至少70%，优选至少75%，优选至少 80%，优选至少85%，优选至少90%，优选至少95%，优选至少100%，更优选至少125%，更优选至 少150%，更优选至少175%，更优选至少200%，和最优选至少250%或300%。甚至更优选地， 所述分子具有的循环半衰期增加至少400%，500%，600%，或甚至700%。
[0040]亲水性聚合物：本发明的侧基优选是非天然存在的亲水性聚合物，其包含至少一 个非天然存在的聚合部分。在另一实例中，非天然存在的修饰基团是经修饰的碳水化合物。
[0041] 示例性的本发明亲水性聚合物包括水溶性聚合物，其可以是直链或支链并且可包 含一个或多个独立选择的聚合部分，例如聚（亚烷基二醇）及其衍生物。本发明的聚合修 饰基团可包括水溶性聚合物，例如聚（乙二醇）及其衍生物（PEG，m-PEG)、聚（丙二醇）及 其衍生物（PPG, m-PPG)等。
[0042] 本发明水溶性聚合物的聚合物主链可以是聚（乙二醇）（即PEG)。本发明相关的 术语PEG包括任何形式的聚（乙二醇），包括烷氧基PEG、双功能PEG、多臂PEG、分叉PEG、分 支PEG、垂悬PEG (即具有挂在聚合物主链上的一个或多个官能团的PEG或相关聚合物）、 或其中具有可降解键的PEG。
[0043] 聚合物主链可以是直链或支链的。支链聚合物主链是本领域公知的。通常，支链聚 合物具有中央分支核心部分和与该中央分支核心连接的多个直链聚合物链。常使用支链形 式的PEG，其可通过将氧化乙烯加成到不同多元醇例如甘油、季戊四醇和山梨醇中而制备。 中央分支部分也可源自若干氨基酸，例如赖氨酸或半胱氨酸。在一个实例中，支链聚（乙二 醇）可以通式表示为R(-PEG-〇H)m，其中R代表核心部分，例如甘油或季戊四醇，m代表臂的 数目。多臂PEG分子，例如美国专利号5,932, 462 (其通过引用全部结合到本文中）中描 述的那些，也可用作聚合物主链。
[0044] 许多其它聚合物也适合本发明。非肽和水溶性的聚合物主链特别可用于本发明。 合适聚合物的实例包括但不限于其它聚（亚烷基二醇）、例如聚（丙二醇）（〃PPG〃）、乙二 醇和丙二醇等的共聚物、聚（氧乙基化多元醇）、聚（稀醇（olefmic alcohol))、聚（乙稀 吡咯烷酮）、聚（羟丙基甲基丙烯酰胺）、聚（[a]_羟基酸）、聚（乙烯醇）、聚磷腈、聚噁唑 啉、聚（N-丙烯酰吗啉）（例如美国专利号5, 629,384 (其通过引用全部结合到本文中）中 描述的），及其共聚物、三元共聚物和混合物。
[0045] 尽管所述聚合物主链每条链的分子量可变化，但典型的范围为约100 Da-约 160,000 Da，例如约5, 000 Da-约100, 000 Da。更具体地讲，每种本发明缀合的亲水性聚合 物的大小可在以下范围内变化：约500 Da-约80, 000 Da，例如约1000 Da-约80, 000 Da ; 约 2000 Da-约 70, 000 Da ;约 5000-约 70, 000 Da ;约 5000-约 60, 000 Da ;约 10, 000-约 70, 000 Da ;约 20, 000-约 60, 000 Da ;约 30, 000-约 60, 000 Da ;约 30, 000-约 50, 000 Da ; 或约30, 000-约40, 000 Da。应当知道，这些大小代表估计值，而并非准确测量值。依据一 个优选的实施方案，将本发明的分子与亲水性聚合物的异质群体缀合，所述聚合物为例如 大小如下的 PEG :例如 10, 000、40, 000 或 80, 000 Da +/-约 5000、约 4000、约 3000、约 2000 或约 1000 Da。
[0046]侧链/侧基：也可将本发明的因子VIII分子与并非亲水性聚合物的侧基缀合。本 发明的侧链可以例如选自以下列出的一种或多种：脂肪酸及其衍生物（有时也称为"白蛋 白结合剂")、肽等。本发明的疏水性侧基优选是生物可降解的。此外，可有不止一个疏水性 侧基与单个因子VIII分子缀合，例如有2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个。此外由此得出 还可将本发明的因子VIII分子与一个或多个疏水性侧基以及一个或多个疏水性侧基、肽 侧基等缀合。
[0047] 因此，单个本发明的因子VIII分子可包含侧基，例如亲水性和疏水性/肽类侧基。 然而，将该分子与不同类型侧基缀合伴随着另外的努力，因此这种解决方案可变得在实践 中相对不实用。本发明的分子因此优选仅包含1种侧链（例如亲水性侧链/疏水性侧链）。
[0048] 然而，迄今为止，并不认为因子VIII同疏水性侧基的缀合是同亲水性基团的缀合 的具有吸引力的备选。一种解释可能是预期到需要采用使用有机溶剂的费力和/或苛刻的 化学方法。另一种解释可能是预期通常相对小的疏水性分子不能有效地将缀合的（大）因 子VIII分子与例如白蛋白结合并因此可能保护分子免于清除。
[0049] 白蛋白结合剂缀合物 已知可通过使用白蛋白结合侧链来改善这种蛋白质的体内性能。这种侧链或白蛋白结 合剂可在给予之前连接到所述蛋白质上并且例如可以在体内稳定所述蛋白质或改进或延 长所述蛋白质的体内半衰期。
[0050] 因此白蛋白结合剂可促进衍生物在血流中循环。白蛋白结合剂可具有延长或延迟 与之结合的蛋白质的作用时间的效果，这是因为以下事实：肽衍生物和白蛋白的复合物仅 缓慢崩解以释放活性药物成分。因此，优选的取代基或侧链作为整体可称为白蛋白结合部 分。
[0051] 白蛋白结合剂（白蛋白结合部分）可包含与白蛋白结合以及因此在血流中循环的 延长特别相关的部分，所述部分因此可称为延长部分。延长部分优选位于白蛋白结合部分 相比于其与肽的连接点的相反一端或附近。
[0052] 在一个优选的实施方案中，白蛋白结合剂是或包含能够与白蛋白形成非共价复合 物的侧链。白蛋白结合剂可与白蛋白非共价结合和/或可逆结合。白蛋白结合剂可与白蛋 白特异性结合。根据下述方法可以清楚的是，白蛋白结合剂可结合到环糊精。白蛋白结合 剂可与环糊精非共价结合和/或可逆结合。白蛋白结合剂可与环糊精特异性结合。
[0053] 本文所述的白蛋白结合剂通常是疏水性基团。
[0054] 白蛋白结合部分的其它部分，即介于延长部分和与肽的连接点之间的部分，可称 为接头部分、接头、间隔物等。然而，这类接头的存在是任选的，因此白蛋白结合部分可与延 长部分相同。
[0055]在特别的实施方案中，白蛋白结合部分和/或延长部分是亲脂的，和/或在生理pH (7.4)下带负电荷。
[0056] 白蛋白结合部分和/或延长部分可通过缀合化学例如烷基化、酰化或形成酰胺而 与肽的氨基共价连接；或通过例如酯化、烷基化、肟化而与羟基共价连接。
[0057]在一个优选的实施方案中，白蛋白结合部分和/或延长部分的活性酯在形成酰胺 键的条件下与唾液酸残基或唾液酸衍生物的氨基共价连接（该过程称为酰化）。
[0058] 除非另有说明，否则当谈及蛋白质酰化时，应当理解为氨基与糖蛋白上的唾液酸 残基连接。
[0059]对于本发明的目的，术语"白蛋白结合部分"、"延长部分"和"接头"包括这些分子 的未反应形式以及反应形式。是否意指一种形式或其它形式，根据其中使用术语的上下文 是清楚的。