针对活化蛋白c的单克隆抗体的制作方法
【专利说明】针对活化蛋白C的单克隆抗体
[0001]本申请是申请号为200880121024.5的中国专利申请的分案申请，原申请是国际申请PCT/US2008/081110的中国国家阶段申请。
[0002]本发明要求2007年10月26日提交的美国临时申请序列号N0.60/983, 092的优先权，其全部内容在此通过弓I用并入本文。
技术领域
[0003]本发明一般性地涉及抗体领域。更具体地，本发明描述了选择性针对活化蛋白C(activated protein，APC)的单克隆抗体和抗体片段的鉴定和用途。
【背景技术】
[0004]血液凝固是由多种血液成分或因子的复杂相互作用组成的过程，其最终导致纤维蛋白凝集。一般地，参与凝血“级联”的血液成分是酶前体或酶原-无酶活性的蛋白质，其通过活化剂的作用转变为活性形式。血液凝固的调节很大程度上由活化蛋白C(APC)实现的促凝血因子(pro-coagulat1n factor) Va和VIIIa的蛋白水解失活通过酶作用完成(Esmon,1989)。
[0005]蛋白C是APC的前体，其为有力的天然抗凝血剂。蛋白C由与凝血调节蛋白(TM)复合的凝血酶所活化。内皮细胞蛋白C受体(EPCR)增强了所述活化。TM和EPCR可被炎性介质(例如肿瘤坏死因子)所下调，由Esmon (1999)综述。也已发现在一些形式的败血症休克特别是脑膜炎球菌血症中TM和EPCR减少。因为EPCR和TM在内皮上表达，所以不可能在不除去血管的情况下直接确定它们的功能的好坏。
[0006]APC通过蛋白水解性切割和下调促凝血因子(pro-coagulant factor)起到抗凝血剂作用。APC还具有作为抗凋亡剂、抗炎症分子和细胞保护剂的重要功能。可通过除去APC来治疗关键因子丧失(例如在血友病中缺乏因子VIII)导致止血失调的出血疾病，或者在外伤过程导致暂时性止血损伤的外伤患者中。但是，这样的治疗除了除去抗凝血活性之夕卜，还可导致除去APC有益功能的不希望的有害后果。因此，希望有一种选择性靶向APC的抗凝血活性而同时保留所述分子的其它功能完好无损的治疗剂。
【发明内容】
[0007]已经开发并在本文中描述了治疗出血疾病的方法，其涉及使用识别活化蛋白C但是不识别未活化蛋白C的单克隆抗体。在这点上，本发明还提供了选择性结合和/或阻断活化蛋白C中蛋白水解活性位点的单克隆抗体。在某些实施方案中，这些抗体可抑制活化蛋白C的抗凝血活性，但是可不影响未活化蛋白C的任何活性。在某些实施方案中，这些抗体还可保留活化蛋白C的细胞保护作用。因此，本发明的方法还包括利用这些单克隆抗体进行治疗，其中希望选择性抑制活化蛋白C的抗凝血活性。
[0008]因此，本发明的某些一般方面涉及单克隆抗体，其中所述抗体结合并抑制活化蛋白C，但是不结合或抑制未活化蛋白C。例如，本发明的某些实施方案涉及单克隆抗体，其中所述抗体结合并抑制活化蛋白C的抗凝血活性，但是不结合或抑制未活化蛋白C的活化。在某些实施方案中，本发明的单克隆抗体是HAPC1573。结合并抑制活化蛋白C及其抗凝血活性的本发明抗体可以在体内和/或体外起作用。
[0009]本发明涉及其他单克隆抗体，例如抑制活化或未活化蛋白C与内皮细胞蛋白C受体(EPCR)或磷脂结合并抑制未活化蛋白C活化的抗体。在某些方面，此类抗体结合小鼠未活化蛋白C的Gla结构域。可以在体外或体内情形下利用这些抗体。
[0010]本发明的抗体可以例如是鼠抗体，本发明的抗体可以例如是人源化抗体。本发明的抗体可以包含在药物组合物中，其中所述药物组合物还包含可药用载体。本发明的抗体还可用于其中抗体与细胞在体外或体内接触的方法中。
[0011]本发明还涉及在对象中抑制活化蛋白C的抗凝血活性的方法，其包括向所述对象(例如哺乳动物，如人)施用有效量的本发明抗体。在涉及施用本发明抗体的本发明方法或任何其它方法中，在某些实施方案中，活化蛋白C的细胞保护作用可以不降低，或者可保持在正常水平内。
[0012]本发明还涉及在对象中抑制活化蛋白C的酰胺裂解活性的方法，其包括向所述对象施用有效量的本发明抗体。
[0013]本发明还涉及治疗需要凝血的对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的本发明抗体。这些对象可患有例如血友病或出血。
[0014]本文还涉及治疗患有败血症的对象的方法，其包括施用有效量的本发明抗体。这些方法还可利用施用活化蛋白C。
[0015]本发明还涉及治疗患有血友病的对象的方法，其包括向所述对象施用有效量的本发明抗体。
[0016]本发明的抗体还可用于例如在对象中调节止血或者在对象中调节血栓形成的方法，其包括施用有效量的本发明抗体。这些方法还可利用施用活化蛋白C。
[0017]本发明的某些方法涉及抑制未活化蛋白C的活化的方法，其包括向对象施用有效量的本发明单克隆抗体。这些方法中所用的抗体还可抑制活化或未活化蛋白C与内皮细胞蛋白C受体(EPCR)或磷脂的结合。
[0018]根据本发明的对象可以是例如哺乳动物，如小鼠、大鼠、兔、狗、马或人。
[0019]除非另作说明，否则本文所述的任何抗体均可以是抗体片段。例如，所述抗体可以进一步限定为Fab'、Fab、F(ab' ) 2、单结构域抗体、Fv’或scFv，其都是众所周知的抗体片段类型。除非另作说明，否则本发明的抗体也包括这些片段。
[0020]如下文所述，术语“抗体”用于表示具有抗原结合区域的任何抗体样分子，包括抗体片段例如FaV、Fab、F(aV ) 2、单结构域抗体(DAB)、Fv、scFv (单链Fv)等。制备和使用多种基于抗体的构建物和片段的方法在本领域中是众所周知的。制备和表征抗体的手段也是本领域中众所周知的(参见例如Antibodies:A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，1988 ;在此通过引用并入本文)。
[0021]本发明的另一个方面涉及包含替代性互补决定区(或CDR)以及构架区(或FR)的可变区。CDR是所述可变区内通常赋予抗原特异性的序列。
[0022]本发明还涵盖包含足以赋予抗原结合之可变区序列的抗体部分。抗体部分包括但不限于Fab、Fab'、F(ab' )2、Fv、SFv、scFv (单链Fv)，无论是由蛋白水解切割完整抗体(例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶切割)产生还是由重组方法产生，其中操纵完整重链和轻链的cDNA来产生重链和轻链的片段，它们分别产生或者作为同一多肽的部分而产生。
[0023]本发明范围内的mAb还包括对应于人抗体、动物抗体和其组合的序列。本文所用的术语“嵌合抗体”包括具有与另一分子(例如来自人抗体的恒定结构域)融合的来自动物抗体(例如大鼠或小鼠抗体)之可变区的抗体。一种嵌合抗体类型“人源化抗体”具有发生了改变的可变区(通过诱变或CDR接枝)以(尽可能地)匹配人可变区的已知序列。CDR接枝包括将来自具有所需特异性之抗体的CDR接枝到人抗体的FR上，由此用人序列替换大量的非人序列。因此，人源化抗体更接近地匹配(在氨基酸序列上)已知人抗体序列。通过将小鼠单克隆抗体人源化，降低了人抗小鼠抗体(或HAMA)应答的严重程度。本发明还包括全人抗体，其尽可能多地避免了 HAMA应答。下文更详细地描述人源化抗体的产生。
[0024]本文所用的“可药用载体”任何和所有的溶剂、分散介质、包衣剂、表面活性剂、抗氧化剂、防腐剂(例如抗细菌剂、抗真菌剂)、等渗剂、吸收延迟剂、盐、防腐剂、药物、药物稳定剂、凝胶、粘合剂、赋形剂、崩解剂、润滑剂、甜味剂、调味剂、染料等材料及其组合，其对于本领域技术人员来说是公知的(参见例如Remington' s Pharmaceutical Sciences，18thEd.Mack Printing Company，1990，1289-1329页)。任何常规载体除非与活性成分不相容，否则均考虑将其用于治疗或药物组合物中。
[0025]在用于细胞时，术语“接触”在本文中用于描述本发明化合物被递送到靶细胞或者处于与靶细胞直接相邻的位置。
[0026]如说明书和/或权利要求书中所用的术语“有效”(例如“有效量”)意为足够实现所期望的、预计的或者计划的结果。
[0027]术语“基本上”及其变化形式定义为在很大程度上但是并不一定完全地，如本领域普通技术人员所理解的，在一个非限制性实施方案中，基本上表示10 %、5 %、I %或0.5 %以内的范围。
[0028]术语“抑制”、“减少”或“防止”或这些术语的任何变化形式，在用于权利要求和/或说明书时包括任何可测量的减少或者完全抑制，以实现所需结果。例如，可以是相比于正常而言活性减少或降低 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、99%或更多或其中引出的任何范围。
[0029]在本申请全文中，术语“约”用于表示包括用于测定数值的装置或方法的固有误差变化，或者研究对象之间存在的变化的值。例如，“约”可以是在10%、优选5%、更优选1%、最优选0.5%内。
[0030]在权利要求和/或说明书中与术语“包括”或“包含”联用时，单数形式可能意为“一个/种”，但是也与“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”的含义一致。
[0031]除非明确指明可选方案是唯一的或者可选方案是互斥的，否则在权利要求中术语“或”的使用意为“和/或”，尽管本公开内容支持表示唯一可选以及“和/或”的定义。
[0032]本说明书中和权利要求书中所用的表述“包括”(以及任何形式的包括)、“具有”(以及任何形式的具有)、“包含”(以及任何形式的包含)或“含有”(以及任何形式的含有)是包含性质的或者开放式的，不排除其它未陈述的要素或方法步骤。
[0033]本发明涉及说明书中所述任何实施方案可针对本发明的任何化合物、方法或组合物而实施，反之亦然。
[0034]通过下述详细说明，本发明的其它目的、特征和优点将变得显而易见。但是，应当理解的是，尽管指出了本发明的优选实施方案，但详细说明和具体实施例仅以举例说明的方式给出，因为从本详细说明出发在本发明精神和范围内的多种变化和修改对于本领域技术人员来说是显而易见的。
【附图说明】
[0035]下列附图构成本说明书的一部分，其用于进一步说明本发明的某些方面。参考这些附图的一个或多个并结合本文给出的具体实施方案的详细说明可更好地理解本发明。
[0036]图1 APC ELISA 标准曲线。
[0037]图2 HAP 1573增强APC在内皮上的结合。
[0038]图3 HAPC1573促进APC内化进EA细胞。
[0039]图4 HAPC1573改变APC对发色底物的酰胺裂解活性。
[0040]图5在血浆凝血测定中HAPC1573阻断APC抗凝血活性。
[0041 ] 图6 HAPC1573增强APC对组蛋白的切割。
[0042]图7A-B HAPC1573对APC针对组蛋白之细胞保护作用的影响。
[0043]图8A-C MPC1609和MAPC1591抑制APC抗凝血活性。(图8A)在无或有125nMMPC1609或MAPC1591存在的情况下将bEnd3细胞与10nM FL-APC 一起在冰上孵育15分钟，进行流式细胞术。(图8B)在无或有10nM MPC1609或MAPC1591存在的情况下将bEnd3细胞与10nM蛋白C和5nM凝血酶一起在37摄氏度下孵育15分钟，通过PC