抑制TNFα的稳定和可溶的抗体的制作方法
【专利说明】抑制TNFa的稳定和可溶的抗体
[0001] 本申请是申请号为200680028415. 3、申请日为2006年6月6日、发明名称为"抑 制TNF a的稳定和可溶的抗体"的中国专利申请的分案申请。
技术领域
[0002] 本发明涉及优化的抗体和抗体衍生物，其与肿瘤坏死因子a (TNF a )结合并阻断 其功能，并具有诊断和/或治疗、预防或改善与TNFa相关的疾病的用途；它们的编码序列、 生产和在药理学上合适的组合物中的应用。
【背景技术】
[0003] 肿瘤坏死因子a (TNFa，亦称恶液质素）是天然存在的哺乳动物细胞因子，由许 多类型细胞对内毒素或其他刺激物应答产生，包括单核细胞和巨噬细胞。TNFa是炎症、免 疫和病理生理反应的主要介质（Grell，M.，等（1995)Cell, 83:793-802)。
[0004] 可溶TNFa由跨膜蛋白前体切割形成（Kriegler，等（1988)Cel 153:45-53)， 分泌的17kDa多肽装配成可溶同源三聚体复合物（Smith,等（1987)，J. Biol. Chem. 262:6951-6954 ;对于 TNF 的综述，参见 Butler,等（1986)，Nature 320:584 ; 01d(1986)，Science 230:630)。然后这些复合物与各种细胞上发现的受体结合。这种结 合产生一系列促炎作用，包括（i)释放其他促炎细胞因子，如白介素（IL)-6、IL-8和IL-1， (ii)释放基质金属蛋白酶和（iii)上调内皮粘附分子的表达，通过吸引白细胞进入血管外 组织而进一步放大炎症和免疫级联。
[0005] 许多紊乱与TNFa水平升高有关，其中很多具有显著的医学重要性。已经证明 TNFa在很多人类疾病中被上调，包括慢性疾病如类风湿性关节炎（RA)，炎性肠紊乱包括 克罗恩病和溃疡性结肠炎，脓毒病，充血性心力衰竭，支气管哮喘和多发性硬化。人TNFa 转基因小鼠组成型产生高水平TNFa并发展为类似RA的自发、有害的多关节炎（Keffer等 1991，EMBOJ.，10, 4025-4031)。因此TNFa被称为促炎细胞因子。
[0006] 现在TNF a已被充分确立为RA发病机理中的关键因素，RA是慢性、进行性和使人 衰弱的疾病，其特征是多关节炎症和破坏，伴发热、不适和疲劳的全身症状。RA还引起慢性 滑膜炎，经常进展为关节软骨和骨破坏。在遭受RA的患者的滑膜液和外周血液中都发现 TNFa水平增加。当将TNFa阻断剂给予遭受RA的患者时，它们减轻炎症、改善症状和延迟 关节损害（McKown 等（l999)，Arthritis Rheum.42:l2〇4_l2〇8) 〇
[0007]在生理学上，TNF a还与保护不受特殊感染的危害相关（Cerami.等 (1988)，Immunol. Today 9:28)。TNFa由被革兰氏阴性细菌的脂多糖激活的巨噬细胞释 放。这样，TNFa可能是与细菌脓毒病相关内毒素性休克的发展和发病机理中涉及的中心 环节的内源介质（Michie,等（1989)，Br.J.Surg. 76:670-671. ;Debets?等（1989)，Second Vienna Shock Forum, p. 463-466 ；Simpson,等（1989)Crit. Care Clin. 5:27-47 ;Waage 等 (1987).Lancet 1:355-357;Hammerle?等（1989)Second Vienna Shock Forum p.715-718 ; Debets?等（1989)，Crit.Care Med. 17:489-497 ;Calandra?等（1990)，J. Infect. Dis.161:982-987;Revhaug 等（1988)，Arch. Surg.123:162-170)〇
[0008] 如同其他器官系统一样，TNFa也被证明在中枢神经系统中起关键作用，尤其是在 神经系统的炎症和自身免疫紊乱中，包括多发性硬化、Guillain-Barre综合征（传染性神 经元炎）和重症肌无力，和在神经系统的退行性紊乱中，包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏症 和杭廷顿氏病。TNFa还参与视网膜和肌肉相关系统的紊乱，包括视神经炎、黄斑变性、糖尿 病视网膜病、皮肌炎、肌萎缩性侧索硬化和肌营养不良，以及神经系统的损害，包括外伤性 脑损伤、急性脊髓损伤和中风。
[0009] 肝炎是另一个与TNFa相关的炎症性紊乱，除了其他触发物之外，它可以由病毒 感染引起，包括EB病毒、巨细胞病毒和A-E型肝炎病毒。肝炎引起门脉和小叶区急性肝炎， 随后是纤维化和肿瘤发展。
[0010] TNFa可以在癌症中介导恶病质，后者引起多数癌症发病和死亡（Tisdale M.J. (2004), Langenbecks Arch Surg. 389:299-305)〇
[0011] TNFa在炎症、细胞免疫反应和很多疾病的病理过程中所起的关键作用导致人们 探寻TNFa拮抗剂。
[0012] TNFa是重要的细胞因子，它的全身阻断带来临床上明显感染的频率和严重性增 加的风险，尤其是潜伏性结核的重新活化和可能的其他风险，包括诱发淋巴瘤、脱髓鞘疾病 和心力衰竭。
[0013] 设计用于治疗TNFa介导的疾病的一类TNFa拮抗剂是特异性结合TNFa并由 此阻断其功能的抗体或抗体片段。抗TNFa抗体的使用表明阻断TNFa可以逆转归因 于TNFa的作用，包括IL-1、GM-CSF、IL-6、IL-8、粘附分子和组织破坏减少（Feldmann等 (1997), Adv. Immunol. 1997:283-350)〇
[0014] 已经提议针对TNFa的抗体用于预防和治疗内毒素性休克 (Beutler等（1985)Science:234,470-474)。Bodmer等于1993年（Critical Care Medicine, 21:441-446，1993)、Wherry等于1993年（Critical Care Medicine, 21:436-440)和Kirschenbaum等于1998年（Critical Care Medicine, 26:1625-1626)论述了抗TNFa抗体在治疗脓毒性休克中的应用。
[0015] US2003147891中已经公开了一种通过给予抗TNFa单克隆抗体或其TNFa结合片 段治疗人类中神经变性疾病的方法。
[0016] W00149321教导了 TNFa阻断剂，包括抗TNFa抗体治疗由TNFa引起的神经疾病 和相关紊乱的用途。它提供了一种通过给予TNFa拮抗剂来治疗所述紊乱的方法。
[0017] W003047510公开了针对TNFa的各种类型的单克隆和改造的抗体，它们的生产、 包含它们的化合物和在药物中的应用。
[0018]对治疗TNFa介导的疾病有用的抗体通常是单克隆抗体（mAB)或改造的抗体，前 者通过杂交瘤技术从天然来源，通常是小鼠而产生。后者相应于天然存在的抗体，因为它们 包含全长重链和轻链，或相应于也可以由天然抗体蛋白水解分裂产生的Fab片段，或相应 于单链scFv抗体，其中重链和轻链可变区的片段通过肽接头连接。
[0019] 抗体的重链和轻链都包含恒定区和可变区。由于非人抗体具有免疫原性，因此在 所谓的"杂种"抗体中，抗体中人样序列的量常常增加，该抗体包含人IgG恒定区和与动物 抗体序列匹配的可变区，该动物抗体在多数情况下是具有期望特异性的鼠抗体。然后这些 可变区可以通过诱变进一步被改动变得更类似于典型的人抗体，产生"人源化"抗体。在又 一个可供选择的方法中，仅仅抗原结合部分，即小鼠抗体可变区的互补决定区（CDRs)与人 抗体的构架区结合，产生"CDR移植"抗体。
[0020] 现有技术中已经描述了针对TNF a的单克隆抗体。Meager等1087 (Hybridoma 6:305-311)描述了针对重组TNFa的鼠单克隆抗体。Shimamoto等于1988年（Immunology Letters 17:311-318)描述了针对TNFa的鼠单克隆抗体在预防小鼠内毒素性休克中的应 用。
[0021] US5919452公开了抗TNFa嵌合抗体以及它们在治疗与TNFa存在相关的病理改 变中的应用。
[0022] Feldman等于（I"8)年（Transplantation Proceedings3。：4126_4：127)、Adorini 等于1997年（Trends in Immunology Todayl8:209-211)和Feldmann等于1997年 (Advanced Immunology64:283-350)论述了抗TNFa抗体在治疗RA和克罗恩病中的应用。 这种疗法中使用的TNF a的抗体一般是嵌合抗体，如US5919452中描述的抗体。
[0023] US20003187231公开了具有结合提高的特征的含至少一个非人⑶R区的人源化抗 TNFa抗体。此外，在国际专利申请W0 92/11383中公开了对TNFa特异性的重组抗体，包 括 CDR 移植抗体。Rankin 等于（1995)，（British J. Rheumatology 34:334-342)描述了这 种CDR移植抗体在RA治疗中的应用。
[0024] W09211383公开了一种对TNF a特异性的重组的人源化⑶R移植抗体，其来源于鼠 单克隆抗体61E7、hTNFI、hTNF3或101. 4,并且它教导了所述抗体的生产和在诊断和/或治 疗与TNFa相关的紊乱中的应用。
[0025] 在仅仅最近才成为市场上可买到的TNFa的特异性抑制剂当中，已经证 明针对TNF a的单克隆、嵌合小鼠-人抗体（英夫利昔单抗，Remicade?;Centocor Corporation/Johnson&Johnson)在治疗 RA 中的临床功效（Elliott et. al. 1994, Lancet 344:1105-1110 ;Mani 等（1998)，Arthritis&. Rheumatism 41:1552-1563).也已经证明英 夫利昔单抗在治疗炎性肠紊乱克罗恩病中的临床功效（Baert等，1999, Gastroenterology 116:22-28.)〇
[0026] US22002037934公开了通过给予抗TNF a抗体如英夫利昔单抗治疗肝炎。
[0027] US6428787教导了用抗TNFa抗体治疗神经疾病和与TNFa相关的疾病，包括英夫 利昔单抗、CDP571和D2E7。
[0028] 业已开发了 一种人抗TNFa单克隆抗体（Abbott)D2E7(Adalimumab)治疗RA 和克罗恩病（W09729131)。Celltech正在开发一种人源化单克隆抗TNFaIgG4抗体 CDP571 (EP0626389)来治疗克罗恩病，和一种人源化单克隆抗TNF a抗体片段CDP870来治 疗RA。US2003185826中公开了局部给予治疗局部紊乱的所述抗体。
[0029]产生了针对众多不同抗原的很多单链抗体（scFvs)，特别是因为使用技术，例如噬 菌体展示或核糖体显示可以容易地选择高结合能力的抗体。而且，可以在微生物系统中生 产scFv抗体，这与生产治疗性全长抗体相比费用较低有关。
[0030] 除常规细胞外和体外应用之外，scFvs也已经成功用于细胞内（Worn等 2000, JBC, 28 ;275(4):2795-2803 ;Auf der Maur 等 2002, JBC, 22 ;277(47):45075-45085 ; Stocks MR, 2004, Drug Discov Today. 15 ;9(22):960-966);因此，已经开发了针对细胞 内抗原的scFvs。通常，功能性scFvs的细胞内表达受到它们的不稳定性、不溶性和形成 聚集体倾向的限制。因为这个原因，使用所谓的"质量控制"筛选已经成功开发了体内筛 选scFv抗体的系统，其在细胞内环境（例如核、细胞质）典型的还原条件下特别可溶和 稳定（TO0148017;Auf der Maur 等（2001)，FEBS Lett. 508:407-412 ;Auf der Maur 等 (2004)，Methods 34:215-224)，并且已经致使鉴定到了为了这种目的的特别稳定和可溶的 scFv构架序列（W003097697)。此外，这些构架在天然氧化条件下细胞外环境中亦显示出异 常的表达水平以及稳定性和可溶性性能增加。因此，这些有利的生物物理和生化特性转化 为有利的高产量和使这些抗体片段一旦对准特异性抗原就能够作为蛋白治疗剂在特定治 疗区域进行局部和/或全身应用。由于scFv抗体和Fab片段与全长抗体相比缺少被单核 细胞例如天然杀伤细胞的Fc受体识别的Fc部分，因此它们不引起依赖于抗体的细胞介导 细胞毒性（ADCC)并因此不会引起由于与非靶细胞上Fc受体结合造成的无特异性的毒性。
[0031] 因此，需要用于治疗与TNF a相关的紊乱如RA的新的有效形式的抗体，尤其是通 过局部给药可以提供持续、可控制疗法且副作用程度低的治疗。本发明提供了有效和连续 治疗关节炎及其他TNFa介导的紊乱的炎性过程或病理生理机制，尤其是各种形式疼痛的 抗体、组合物和方法。
[0032] 本文引用的全部出版物和参考文献以它们的整体在此引入作为参考。
[0033] 发明公开内容
[0034]因此，本发明的一般目的是提供在体外和体内特异性结合TNF a的稳定和可溶的 抗体或抗体衍生物。在优选实施方案中，所述抗体衍生物是scFv抗体或Fab片段。
[0035] 现在，为了实施本发明的这些目的和随着描述的进行会变得更显然的其它目的， 所述抗体或抗体衍生物表现出以下特征：它包含是或衍生自序列SEQ ID NO: 1的轻链可变 域，其与是或衍生自序列SEQ ID N0:2的重链可变域组合，其中在衍生序列的情况下，所述 序列在所述VL域的构架区内具有最多达到5个改变和/或在所述VH域的构架内具有最多 达到9个改变。
[0036] 本发明的一个优选实施方案是所述抗体或抗体衍生物，其中在构架区中任何位置 导入一个或多个氨基酸改变，优选在选自下组的一个或多个位置：VL域的4、46、65、67、70 和83位，和/或在选自下组的一个或多个位置：VH域的11、16、28、43、48、68、70、71、72、73、 76、77、79、93和112位。更优选，至少一个转变产生在3￡0 10勵:3(对于￥〇和/或3￡0 IDN0:4 (对于VH)中存在的氨基酸，和甚至更优选总共存在最多13个转变。
[0037] 最优选，所述抗体或抗体衍生物包含序列SEQ ID N0:1的VL域和/或序列SEQ ID NO: 2的VH域或衍生自该序列SEQ ID NO :2的VH域，或序列SEQ ID NO: 11的VL域和序 列SEQ ID NO: 4的VH域。如果本发明抗体的VH域包含SEQ ID NO: 1的VL域，在优选实施 方案中，VH序列衍生自SEQ ID N0:2使得在68位苯丙氨酸转变为丙氨酸、亮氨酸、异亮氨 酸或缬氨酸。VH内外加的改变是任选的。这个类型的scFv抗体在SEQ ID N0:31、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36 和 SEQ ID NO:37 中给出。
[0038] 在本发明的另一个优选实施方案中，所述抗体或抗体衍生物衍生自具有VL序列 SEQ ID N0:1和VH序列SEQ ID N0:2的抗体，并且包含至少一个在至少一个CDRs中转变 为VL序列SEQ ID N0:5和/或VH序列SEQ ID N0:6或SEQ ID N0:25的相应CDR中存在 的残基的氨基酸残基。
[0039] 在本发明的非常优选的实施方案中，在所述抗体或抗体衍生物中，VL CDR2、VL CDR3、VH CDR2或VH CDR3中至少一个CDR转变为VL序列SEQIDNO: 5和/或VH序列SEQ IDNo:25 或 SEQIDN0:6 的相应CDR。
[0040] 最优选，所述抗体或抗体衍生物包含下列VL/VH序列组合：
[0041] VL SEQ ID N0:7/VH SEQ ID N0:2、
[0042] VL SEQ ID N0:8/VH SEQIDN0:2、
[0043] VL SEQ ID N0:1/VH SEQIDN0:9、
[0044] VL SEQ ID N0:1/VH SEQ ID N0:25、
[0045] VL SEQ ID N0:1/VH SEQIDN0:28、
[0046] VL SEQ ID N0:1/VH SEQIDN0:29、
[0047] VL SEQ ID N0:26/VH SEQ ID N0:30、
[0048] VL SEQ ID N0:27/VH SEQ ID N0:30〇
[0049] 在另一个优选实施方案中，本发明的抗体或抗体衍生物对人TNFa具有特异性。 优选，抗原结合的特征是1^为~100nM或更低。更优选，抗体的K为10nM或更低，最优选 InM或更低。
[0050] 根据本发明的抗体衍生物是例如Fc融合体、毒素融合体、与酶活性的融合体、不 同形式如微抗体（minibodies)、双功能抗体（diabodies)、线性抗体、单链抗体、双特异性 抗体片段，特别是scFv和Fab片段。
[0051] 本发明的另一个优选目的是scFv抗体，其VL和VH域通过接头连接，优选以VL-接 头-VH序列方式排列。更优选所述接头具有序列SEQ ID N0:10。
[0052] 本发明的另一个优选目的是衍生自SEQIDNO: 40 (TB-A)的scFv抗体。这种抗体 可以通过诱变获得，和在构架区、CDR和/或接头序列中包含三个或更少突变。优选，scFv 抗体具有序列 SEQIDN0:20、SEQIDN0:21、SEQIDN0:22、SEQIDN0:23、SEQIDN0:24、 SEQIDN0:31、SEQIDN0:32、SEQIDN0:33、SEQIDN0:34、SEQIDN0:35、SEQIDN0:36、 SEQIDNO:37 或 SEQIDNO:38.
[0053] 本发明的另一个优选目的是Fab片段，其包含与人Igk链恒定区融合的VL域，和 与人IgG的CH1域融合的VH域，两个融合多肽通过链间二硫键连接。
[0054] 在又一个方面，本发明的抗体或抗体衍生物，例如抗体片段被标记或化学修饰。
[0055] 本发明还提供了编码本发明任何抗体或抗体衍生物的DNA序列，以及含所述DNA 序列的克隆或表达载体。此外，提供了用所述DNA序列转化的适当的宿主细胞，优选是大肠 杆菌、酵母或哺乳动物细胞。
[0056] 此外，提供了生产本发明抗体或抗体衍生物的方法，包括在允许抗体或抗体衍生 物合成的条件下培养用编码任何所述抗体或抗体衍生物的DNA转化的宿主细胞，和从所述 培养物中回收所述分子。优选，所述方法提供了从大肠杆菌纯化的scFv抗体或Fab片段。
[0057]