免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于免疫治疗领域，具体涉及免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体，还涉 及嵌合受体在制备治疗恶性肿瘤或病毒感染性疾病的药物中的应用。
【背景技术】
[0002] 针对肿瘤和慢性感染的过继性T细胞治疗（adoptive cell therapy，ACT)是一个 新兴的并且展现出巨大潜力的领域。这种疗法以合成生物学作为基础对T淋巴细胞进行修 饰使其表达高亲和性的抗原受体从而克服免疫耐受机制，对靶细胞进行高效杀伤，进而达 到治疗的目的。当前对于肿瘤的过继性T细胞治疗进展迅速，其中用靶向CD-19抗原的CAR 修饰的T细胞治疗化疗耐受性急性淋巴细胞白血病取得了良好的临床效果（Sci Transl Med 5, 177ra38 (2013))。通常T细胞的活化需要两个信号的刺激，其中，T细胞表面TCR-CD3 复合体与抗原肽-MHC分子结合，提供T细胞活化的第一信号，决定T细胞的杀伤特异性；T 细胞表面的共刺激分子（如CD28)与相应配体（如B7)结合，提供T细胞活化的第二信号， 促进T细胞活化、增殖与存活。但由于肿瘤细胞存在HLA下调的免疫逃逸机制和抗原加工 途径改变的免疫逃逸机制，导致在生理条件下无法有效提供T细胞活化相关的信号，从而 激活T细胞免疫反应。为了解决这个问题，人们采用嵌合抗原受体CAR的方式对T细胞进 行修饰，从而绕开上述限制杀伤肿瘤细胞。
[0003] 嵌合抗原受体CAR由一个scFv单链抗体（由抗体VL区氨基酸序列和VH区氨基酸 序列经Linker连接而成），通过铰链结构与源于TCR复合体或者IgE高亲和受体的跨膜和 胞内信号结构连接构成。表达CAR的T细胞可通过非MHC限制性途径与抗原反应。经过多年 的发展，CAR受体已由最初的第一代受体发展为第三代受体。第一代CAR受体，包含胞外特 异识别肿瘤抗原的scFv片段，胞内激活信号由⑶3 G或Fc e RI y的ITAM(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs)信号链来传递。但是第一代CAR受体缺乏T细胞 的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少。第二 代CAR受体在第一代CAR的基础上增加了一个共刺激信号分子的胞内结构域，提供T细胞 活化的两种信号，包括如 CD28, CD134/0X40, CD137/4-1BB，lymphocyte-specific protein tyrosine kinase (LCK)，inducible T-cell co-stimulator (IC0S)以及 DNAX-activation proteinlO(DAPlO)等结构域，增强了 T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，IL-2、 IFN- y以及GM-CSF增加，从而突破肿瘤微环境的免疫抑制、延长AI⑶(activation induced cell death，AI⑶）。第三代CAR受体，在第二代CAR的基础上，增加了另外一种共 刺激信号分子的胞内结构域，如在共刺激结构CD28和ITAM信号链的之间再融合一个二级 共刺激分子如4-1BB，产生一个三重信号的CAR受体，第三代CAR受体改造的T细胞具有更 好的效应功能和体内存活时间。
[0004] 虽然第二第三代的CAR受体能够在很大程度上提高对T细胞激活、增殖及杀伤能 力，但是由于肿瘤细胞会表达免疫抑制因子如PD-1、CTLA-4、TGF-P、VEGF、IL-10等，当免 疫细胞上的相关受体与这些抑制因子结合后会迅速诱导该免疫细胞的失活甚至凋亡从而 使肿瘤细胞产生免疫逃逸免于受到攻击。这使得CAR修饰的T细胞的肿瘤杀伤作用大大降 低。
[0005] 基于上述原因，我们希望寻求一种能够稳定提升CAR修饰的T细胞的杀伤效能的 方法从而获得良好的临床疗效。
【发明内容】
[0006] 有鉴于此，本发明的目的在于提供免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体，本发明 的目的之二在于提供嵌合受体在制备治疗恶性肿瘤或病毒感染性疾病的药物中的应用。
[0007] 为实现上述发明目的，经研究，本发明提供如下技术方案：
[0008] 免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体，包括免疫抑制因子受体和肿瘤抗原受体， 所述免疫抑制因子受体依次由信号肽I、至少一个结合肿瘤免疫抑制因子受体、跨膜区I 和胞内共刺激信号分子胞内结构域组成；所述肿瘤抗原受体依次由信号肽II、至少一个肿 瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原、跨膜区II、胞内免疫受体酪氨酸活化基序组成。
[0009] 本发明中，配体为可以和所述肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原、免疫抑制因子特 异性结合的分子，例如可以为蛋白、多肽或抗体。
[0010] 优选的，所述肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原为CD19、CD20、CEA、GD2(又称 B4GALNT1 beta-1, 4-N-acetyl-galactosaminyl transferasel)、FR(Flavin reductase)、 PSMA(Prostate-specific membrane antigen)、 gplOO(PMEL premelanosome protein)、 CA9 (carbonic anhydrase IX)、CD171/L1-CAM、IL-13R a 2、MART-1(又称 melan-A)、 ERBB2、NY-ES0_1 (又称 CTAG1B，cancer/testis antigen IB)、MAGE (Melanoma-associated antigen El)家方矣蛋白、BAGE (B melanoma antigen family)家方矣蛋白、GAGE (growth hormone releasing factor)家方矣蛋白、AFP (alpha-fetoprotein)、MUC1 (mucin 1，cell surface associated)、 CD22、 CD23、 CD30、 CD33、 CD44v7/8、 CD70、 VEGFR1、 VEGFR2、 IL-llRa、EGP-2、EGP-40、FBP、⑶3(又称 ST8SIA1，ST8alpha-N-acetyl-neuraminide alpha-2, 8-sialyltransferase 1)、PSCA(prostate stem cell antigen)、FSA (又 称 KIAA1109)、PSA(又称 KLK3，kallikrein-related peptidase 3)、HMGA2、fetal acetylcholine receptor(fetal_AChR)、LeY(又称 FUT3)、EpCAM、MSLN(mesothelin)、 IGFR1、EGFR、EGFRvIII、ERBB3、ERBB4、CA125(又称 MUC16, mucin 16, cell surface associated)、CA15-3、CA19-9、CA72-4、CA242、CA50、CYFRA21-1、SCC (又称 SERPINB3)、 AFU(又称 FUCA1)、EBV-VCA、P0A(又称 VDR，vitaminD(l，25-dihydroxyvitamin D3) receptor)，0 2-MG(beta-2-microglobulin)、PR0GRP (GPR gastrin-releasing peptide)、 FreeP-hCG、SCCA、P2-MG、R0R1、间皮素（mesothelin)、c-Met、糖脂 F77、⑶-2、 NY-ES0-1TCR中的至少一种；所述肿瘤免疫抑制因子受体为ro-1、CTLA-4、LAG3、HM3中的 至少一种；所述胞内共刺激信号分子胞内结构域为⑶28、⑶134/0X40、⑶137/41BB、LCK、 IC0S或DAP10中的至少一种；所述胞内免疫受体酪氨酸活化基序为⑶3 G和Fc e RI y的 免疫受体酪氨酸活化基序信号链；所述跨膜区为⑶28、⑶8、⑶3 G、⑶134、⑶137、IC0S或 DAP10跨膜区。
[0011] 优选的，所述信号肽I和信号肽II为相同信号肽或不同信号肽。
[0012] 优选的，所述肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原为CEA ;所述肿瘤免疫抑制因子受 体为ro-1 ;所述胞内共刺激信号分子胞内结构域为CD28和CD137/41BB ;所述胞内免疫受 体酪氨酸活化基序为CD3 G的免疫受体酪氨酸活化基序信号链；所述跨膜区I为CD28,所 述跨膜区II为⑶8。
[0013] 优选的，所述免疫抑制因子受体的氨基酸序列如SEQ ID N0. 3所示，所述肿瘤抗原 受体的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0014] 更优选的，所述免疫抑制因子受体的核苷酸序列如SEQ ID NO. 4所示，所述肿瘤抗 原受体的核苷酸序列如SEQ ID N0. 2所示。
[0015] 更优选的，所述免疫抑制因子受体