和肿瘤抗原受体由两个载体分别表达或由一个 载体融合表达。蛋白质前体加工酶识别序列可以为Furin-2A，其核苷酸序列如SEQ ID N0. 6 中第1093~1968位所示，当两种嵌合抗原受体表达后，将被剪切成两个独立的蛋白，分别 运输至细胞膜。
[0016] 本发明中所述的载体选自真核表达质粒、重组病毒；所述真核表达质粒例如可以 为pSV2、pRSV、pcDNA3. 1、pCI和pVAXl、转座子质粒；所述重组病毒例如可以为重组逆病 毒、重组慢病毒，本发明的一个实施方案中，所述载体改造至第三代自身失活型面病毒载体 pRRLSIN.cPPT.PGK-GFP.WPRE。
[0017] 更优选的，所述融合表达的融合序列为由蛋白质前体加工酶识别序列连接免疫抑 制因子受体和肿瘤抗原受体的序列。
[0018] 本发明中可以将嵌合受体与包装为病毒，将表达肿瘤抗原受体和免疫抑制因子受 体的表达载体整合到宿主细胞基因组中使其稳定表达两种嵌合受体的重组病毒。
[0019] 优选的，所述的病毒包括慢病毒，腺病毒和逆转录病毒，更优选为第三代自身失活 型慢病毒。
[0020] 本发明中，包装需要借助包装细胞系，包括PT67, NIH3T3, PG13, 293T优选的，所述 包装细胞系为293T。
[0021] 本发明中，包装为病毒包装即是将包装质粒、包膜质粒、载体质粒导入到包装细胞 系中使其表达，然后在细胞外组装成高滴度慢病毒。
[0022] 本发明中，通过将慢病毒导入免疫反应细胞，使嵌合抗原受体得以表达，来对细胞 进行遗传修饰。所以免疫反应细胞选自T细胞、单核细胞（monocyte)、自然杀伤细胞（NK细 胞）、中性粒细胞；其中所述T细胞例如可以为细胞毒性T淋巴细胞、NKT细胞、辅助T细胞、 或抑制/调节性T细胞。
[0023] 2、所述免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体在制备预防和/或治疗恶性肿瘤或 病毒感染性疾病的药物中的应用。
[0024] 优选的，所述恶性肿瘤为肺癌、肝细胞癌、淋巴瘤、结肠癌、大肠癌、乳腺癌、卵巢 癌、宫颈癌、胃癌、胆管癌、胆囊癌、食管癌、肾癌、神经胶质瘤、黑色素瘤、胰腺癌或前列腺 癌；所述病毒为艾滋病病毒、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、EB病毒、乳头瘤病毒、疱疹病毒 或巨细胞病毒。
[0025] 发明详述
[0026] 本发明中术语"嵌合抗原受体"是人工改造受体，能够将识别肿瘤抗原的特异性分 子（如抗体）锚定在免疫细胞（如T细胞）上，使免疫细胞识别肿瘤抗原或病毒抗原和杀 死肿瘤细胞或病毒感染的细胞。
[0027] 本发明中术语"T细胞活化相关信号"是指与T细胞活化所需要两个信号，即T细 胞表面TCR-CD3复合体与抗原肽-MHC分子结合，提供T细胞活化的第一信号，决定T细胞 的杀伤特异性；T细胞表面的共刺激分子（如CD28)与相应配体（如B7)结合，提供T细胞 活化的第二信号，促进T细胞活化、增殖与存活。
[0028] 本发明中术语"免疫受体酪氨酸活化基序"（immunoreceptor tyrosine-base activation motifs，ITAM)是指免疫细胞活化相关受体（如 BCR/Iga/Ig0，TCR/Q33、 Fc a R和FcRy等）胞浆区所共有的以酪氨酸残基（tyrosine，Y)为基础的氨基酸序列基 序，其特征为：两个酪氨酸残基被大约13外其它氨酸残基隔开（???YXX[L/V]X 7_11YXX[L/ V]…），其中酪氨酸是蛋白激酶磷酸化位点，被磷酸化后能够与信号转导途径下游的信号分 子结合，导致细胞的活化。
[0029] 本发明中术语"共刺激信号分子"(C〇-stimulating molecule)是指免疫细胞表面 的一些粘附分子，如⑶28、⑶134/0X40、⑶137/4-1BB、⑶40等，通过与其配体结合，激活免 疫细胞的第二信号，增强免疫细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，延长活化免疫细胞 的存活时间。
[0030] 发明中术语"肿瘤特异性抗原"（tumor specific antigen, TSA)是肿瘤细胞特有 的或只存在于某种肿瘤细胞而不存在于正常细胞的新抗原。
[0031] 发明中术语"肿瘤相关抗原"（tumor-associated antigen, TAA)是指非肿瘤细胞 所特有的、正常细胞和其他组织上也存在的抗原，只是其含量在细胞癌变时明显增高的抗 原。
[0032] 发明中术语"免疫抑制因子（Immunosuppressive factor) "是指肿瘤细胞表面表 达的一系列通过抑制各种免疫细胞在瘤组织中的浸润，增殖，分化，活化，或诱导免疫细胞 凋亡，或抑制瘤细胞表面靶细胞识别抗原的表达，或封闭由细胞因子启动的信号传导通路 等方式使肿瘤细胞免于受到免疫细胞的攻击的因子
[0033] 发明中术语"单链抗体"（single-chain antibody variable region fragment, scFv)是指由抗体VL区氨基酸序列和VH区氨基酸序列经Linker连接而成，具有 结合抗原能力的抗体片段。
[0034] 发明中术语"程序性死亡蛋白 1"（Programmed cell death protein 1，PD-1)作 为B7-CD28家族的重要负性共刺激信号途径，已证实能够通过抑制T细胞的活化增殖及细 胞因子的产生来负调控免疫应答，参与免疫耐受及自身免疫性疾病、慢性感染、肿瘤等慢性 疾病。
[0035] 本发明中，所述肿瘤抗原受体与CD3共同组成一个嵌合抗原受体负责产生并传递 T细胞活化的第一信号，所述免疫抑制因子受体与CD28、CD137/4_1BB等功刺激信号共同组 成一个嵌合抗原受体负责产生并传递T细胞活化的第二信号，两个嵌合抗原受体各自独立 与各自的配体结合，并分别将结合后产生的信号转导入细胞内。
[0036] 本发明中，所述Linker是连接不同蛋白或多肽之间的多肽片段，其目的是使所连 接的蛋白或多肽保持各自的空间构象，以维持蛋白或多肽的功能或活性。
[0037] 本发明中，所述多肽通常是指长度在1-100个氨基酸的肽链分子；蛋白通常是指 长度大于1〇〇个氨基酸的肽链分子。
[0038] 在本发明中所述"选自"是指选自所列项目中的一种或数种。
[0039] 本发明的有益效果在于：本发明公开了免疫抑制受体联合肿瘤抗原嵌合受体，以 T细胞作为CAR修饰的对象，将第一信号和第二信号从单一的CAR中分开，构建双信号独立 的嵌合抗原受体，其中肿瘤抗原受体与CD3等组成一个CAR，识别肿瘤特异性抗原和肿瘤相 关抗原来产生和传递T细胞活化的第一信号，决定T细胞杀伤特异性；而免疫抑制因子受体 与⑶28、⑶137/4-1BB等共同组成一个CAR负责产生并传递T细胞活化的第二信号，促进T 细胞活化、增殖与存活。这样经过CAR修饰的T细胞表面会形成两个针对同一个免疫抑制 因子的受体，但是这两个受体在与免疫抑制因子结合后所产生的效果却完全相反，T细胞原 有的免疫抑制因子受体在与配体结合后会诱导T细胞的失活或者凋亡，而CAR修饰的免疫 抑制因子受体在与配体结合后会产生并传递T细胞活化的第二信号，促进T细胞活化、增殖 与存活，这样两个免疫抑制因子受体就会竞争结合肿瘤细胞表面的免疫抑制因子，虽然仍 有一部分CAR修饰的T细胞在与免疫抑制因子结合后会失活或凋亡，但另一部分CAR修饰 的T细胞在与免疫抑制因子结合后会促进T细胞活化、增殖与存活，这样即可大幅提高CAR 修饰的T细胞对肿瘤细胞的杀伤效能。
[0040] 除T细胞外，本发明同样适用于其它免疫反应细胞，例如单核细胞、NK细胞、中性 粒细胞。
[0041] 同时，本发明中的免疫抑制因子受体可以是多种免疫抑制因子受体的组合因而适 用于各种恶性肿瘤以及同种类型的恶性肿瘤细胞由于异质性而表达不同免疫抑制因子的 情况，进而达到增加CAR修饰的免疫细胞的杀伤效能的作用。
【附图说明】
[0042] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图：
[0043] 图1为靶向CEA抗原的嵌合抗原受体的结构图（A :靶向CEA抗原的嵌合抗原受体 与靶向PD-1配体的嵌合受体联合示意图；B :CAR1CEA，CAR2PD1，CAR1CEACAR2PD1，CAR3CEA 序列组成示意图）。
[0044] 图2为表达不同CAR的T细胞体外培养时的增殖情况。
[0045] 图3为表达CAR1CEA、CAR3CEA和CAR1CAR2PD1的T细胞靶向CEA抗原的CAR的表 达检测及PD1分子的检测。
[0046] 图4为表达CAR1CEA、CAR2PD1、CAR3CEA和CAR1CAR2PD1的T细胞对靶细胞作用后 IFN-y的释放水平检测。
[0047] 图5表达CAR1CEA、CAR2PD1、CAR3CEA和CAR1CAR2PD1的T细