胞对靶细胞杀伤能力 的检测。
【具体实施方式】
[0048] 下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。实施例中未注明具体 条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南（第三版，J.萨姆布鲁克等 著）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0049] 实施例1、CAR表达框的合成与表达载体的构建
[0050] 设计一个免疫抑制因子受体和一个肿瘤抗原受体在内的双信号嵌合抗原受体，分 别为 CAR1CEA、CAR2PD-1 和 CAR1CEACAR2PD-1，结构如图 1 所示。
[0051] 其中 CAR1CEA 依次由信号肽 1、VLCEA、Linkerl、VHCEA、CD8a higle、CD8TM 和⑶融合构建成嵌合抗原受体，命名为信号肽1-VLCEA-Linkerl-VHCEA-⑶8a higle-⑶8TM-⑶3G融合构成，其氨基酸残基序列如SEQ ID NO. 1所示，编码的基因序列如 SEQ ID N0. 2所示。SEQ ID N0. 2中第1-54位为信号肽1，第55-372位为VLCEA (简称VL)， 第 373-426 位为 Linker 1，第 427-798 位为 VHCEA (简称 VH)，第 799-963 位为 CD8a higle (简 称 CD8a)，第 964-1047 位为 CD8TM (简称 TM)，第 1048-1383 位为 CD3 G (简称 CD3)。
[0052] CAR2TO-1依次由信号肽2、PD-1、CD28和CD137/41BB融合构建成嵌合抗原受体， 命名为2-PD-1-CD28-CD137/41BB，其氨基酸残基序列如SEQ ID N0. 3所示，编码的基因序 列如SEQ ID N0. 4所示。SEQ ID N0. 4中第1-465位为TO-1胞外结构域（简称TO-1，由于 ro-1胞外结构域能够定位于细胞膜，因此也相当于信号肽2)，第466-705位为CD28跨膜及 胞内结构域（简称CD28)，第706-834位为CD 137胞内结构域（简称CD 137/41BB)。
[0053] CAR1CEA CAR2PD-1 由 CAR1CEA 与 CAR2PD-1 经 Furin-2A (SEQ IDN0.6 核苷酸序列 第1384~1449位所示）连接构成，其氨基酸残基序列如SEQ IDNO.5所示，编码的基因序 列如SEQ IDN0.6所示。
[0054] 同时设计对照CAR3CEA，依次由信号肽1、VLCEA、Linker 1、VHCEA、 ⑶8a higle、⑶8TM、⑶28、⑶137/41BB和⑶3 G融合构建成嵌合抗原受体信号肽 l-VLCEA-Linkerl-VHCEA-CD8a higle-CD8TM-CD28-CD137-CD3G，结构如图 1 所示，氨基酸 序列如SEQ ID N0. 7所示，编码的基因序列如SEQ ID N0. 8所示。SEQ ID N0. 8中，第1-54 位为信号肽1，第55-372位为VLCEA (简称VL)，第373-462位为Linker 1，第463-798位为 VHCEA (简称 VH)，第 799-963 位为 CD8 a higle (简称 CD8)，第 964-1048 位为 CD8 TM (简称 TM)，第1049-1170位为CD28胞内结构域（简称CD28)，第1171-1300位为CD137胞内结构 域（简称⑶137)，第1301-1635位为⑶3 G胞内机构域（简称⑶3 〇。
[0055] 此外信号肽1和信号肽2序列可以为相同的信号肽，也可以为不同的信号肽；本 发明中使用不同的信号肽，信号肽1为SEQ ID N0. 2中第1-54位核苷酸序列；信号肽2为 ro-i胞外结构域。
[0056] 根据 CAR1CEA、CAR2PD-1、CAR1CEACAR2PD-1 和 CAR3CEA 的基因编码序列，委托生 工生物工程（上海）有限公司合成，然后将合成的序列插入pRRLSIN. cPPT. EFla-GFP. WPRE 载体（Trono实验室）的Nhel与Sail多克隆位点之间，然后将重组载体转化到E. coli Stable3,筛选阳性克隆，并送测序公司测序，经测序验证正确后，使用Qiagen公司的质粒 纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得各重组表达载体的高品质质粒。
[0057] 实施例2、表达CAR序列的慢病毒制备
[0058] 将实施例1中构建并纯化获得高品质慢病毒质粒，利用磷酸钙将其与慢病毒包装 质粒pMD2. G、pMDLg/pRRE、pRSV-Rev转染至293T细胞，48h后收集上清，并通过PEG600离 心纯化，分别获得表达CAR1CEA、CAR2PD-1、CAR1CEACAR2PD-1或CAR3CEA的慢病毒。
[0059] 实施例3、稳定表达人源PD1配体1 (B7H1)的肿瘤细胞系的构建
[0060]B7H1基因CDS序列购于义翘神州公司（货号HG10084-M)，然后用引物5'_agagct agcatgaggatatttgctgtc-3'（SEQ ID NO. 9)和 5'-attgtcgacttacgtctcctccaaatg-S'（SEQ ID NO. 10)进行PCR扩增，扩增获得的片段用限制性内切酶Nhel和Sail进行双酶切，并将 酶切产物连接至pRRLSIN. cPPT. EFla-GFP. WPRE载体的Nhel和Sail酶切位点处，连接产 物转化到E. coli Stable3,筛选阳性克隆，获得pRRLSIN. cPPT. EFla-B7Hl. WPRE，经测序验 证后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得各重组表达载体的高品质 质粒。再按照实施例2中的方法利用磷酸钙将其与慢病毒包装质粒pMD2. G、pMDLg/pRRE、 pRSV-Rev转染至293T细胞，48h后收集上清，并通过PEG600离心纯化获得表达B7H1基因 的慢病毒载体。
[0061] 将 pRRLSIN. cPPT. EFla-B7Hl. WPRE 病毒载体于 24 孔板中感染 Lovo、SW480、HT29 细胞（均购自ATCC，1 X 105/孔），利用流式细胞技术筛选稳定表达B7H1的细胞系。
[0062] 实施例4、遗传修饰外周血来源T细胞细胞表型及增殖情况测定
[0063] 将人外周血来源的单个核细胞PBMC培养在含10% FBS (体积分数）的RPMI 1640 完全培养基中，通过抗CD3单克隆抗体活化2天后，加入20M0I的慢病毒载体，24h后更换含 有500IU/ml的重组人IL-2的RPMI 1640完全培养基中继续培养12天。通过细胞计数方式 记录细胞感染病毒后的第1、5、6、7、9、12天的细胞数，绘制细胞生长曲线，结果如图2所示。 结果显示表达CAR1CEACAR2PD1的CAR-T细胞增殖能力与传统的表达CAR3CEA的CAR-T细胞 无显著差异，较表达CAR1CEA的CART细胞更具有增殖优势，但细胞增殖能力低于CAR2TO1T。
[0064] 通过流式细胞技术检测第10天的细胞表面CAR分子及PD1分子的表达水平，用 浓度为lng/ml的Pierce?Recombinant Protein L(赛默飞生物科技有限公司公司，货号 21189)作为一抗与CAR结合，与1 X 106CART细胞于100 y 1体积4°C下孵育30min，lOOOrpm 离心5min，收集沉淀用100 y 1含0? 1 % BSA的PBS重悬，加入1 y 1浓度为lng/ml的647 标记的Str印tavidin(赛默飞生物科技有限公司公司，货号：21189S)作为二抗于4°C下孵 育30min，加入5yl PE-标记的小鼠抗人⑶279单克隆抗体（BD Pharmingen公司，货号 558694)，lOOOrpm离心收集沉淀，反复操作两次，最终用200 y 1含0. 1 % BSA的PBS重悬，上 流式细胞仪（BD FACSAria II)检测，结果如图3所示。结果显示无论CAR1CEA T、CAR3CEA T还是CAR1CEACAR2PD1T均可表达一定比例的CAR分子，但仅CAR1CEACAR2PD1 T约40 %的 细胞可表达PD1分子，其他2个CART仅5. 8% -8. 2%的比例细胞表达本底水平PD1分子， 说明CAR1CEACAR2TO1 T成功的在T细胞上同时表达CAR1CEA分子和CAR2PD1分子。
[0065] 实施例5、CAR1CEA CAR2TO1遗传修饰后T细胞株IFN y分泌量测定
[0066] 将 CAR1CEA、CAR2PD1、CAR3CEA 及 CAR1CEACAR2PD1 修饰的 T 细胞以及未修饰的 T 细胞（5 X 105/ 孔）在 24 孔板中与 Lovo、SW480、HuH7, HEK293 (均购自 ATCC，1 X 105/ 孔）， Lov〇