的强极性杂质，然后依次用20 %甲醇、40 %甲醇、60 %甲醇、80 %甲醇、100 %甲醇4°C下以，流速0.18?0.20cm/min进行洗脱，分别收集洗液。利用紫外分光光度计检测洗脱液在420nm下的OD值，将有最大吸收的组分用旋转蒸发仪适当蒸去甲醇和部分水分，冷冻后，真空冷冻干燥，获得白色粉末即为FQR-8。
[0035]《实施例2》免疫细胞DC-CIK和CIK的分离、诱导、培养
[0036]患者准备:根据免疫细胞DC-CIK和CIK治疗的适应症和禁忌症，选择适合该治疗的肿瘤患者，告知该治疗所涉及的各种相关信息和注意事项，获得患者及家属的理解和配合，签署知情同意书，检测血常规；
[0037]外周血动员:采血前24小时，应皮下注射集落刺激因子(GM-CSF) 150ug ；
[0038]外周血采集:病人采血前应清淡饮食，无菌抽取肿瘤疾病患者外周血50ml，肝素钠抗凝并充分混匀，避免凝血；
[0039]肿瘤抗原获取:室温2000rpm离心沉淀10分钟，收集适量的上层血浆，加入诱导培养基(Gibico)诱导DC-CIK和CIK细胞培养。细胞沉淀物用于分离单个核细胞；
[0040]单个核细胞分离:细胞沉淀物用生理盐水稀释混匀至原体积，轻轻加至淋巴细胞分离液表面，2000rpm，离心20分钟；
[0041]收集单个核细胞:离心结束，用一次性塑料巴氏小心收集淋巴细胞分离液表层细胞，移至50ml —次性塑料离心管中，加入生理盐水至50ml，混勾；
[0042]单个核细胞的洗涤:室温1500rpm离心沉淀单个核细胞5分钟。弃上清，沉淀物用生理盐水再次悬浮混匀，室温1300rpm离心沉淀5分钟；弃上清，沉淀物用生理盐水再次悬浮混匀，室温IlOOrpm离心沉淀5分钟；
[0043]DC-CIK和CIK细胞的诱导、培养:离心结束，弃上清，沉淀物用含浓度为10ug/ml的FQR-8的FQR-DC-CIK和CIK诱导培养基悬浮，并用白细胞稀释液(上海哈灵生物科技有限公司)适当稀释计数。均分至4个75cm2的一次性塑料细胞培养瓶中，补充诱导培养基至50ml/瓶。置37°C、5% CO2、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养。其间，根据细胞的生长状况，适时换液扩增，直至细胞数量达到实验所需。
[0044]第1、4、7、14、21天分别计算FQR-CIK诱导培养基和CIK培养基中细胞数量，结果如(图1)所示。说明FQR-8能有效提高CIK细胞的增殖。同时，在免疫细胞显微镜下可以观察到FQR-8诱导DC-CIK细胞密度的增加(图2)。
[0045]《实施例3》诱导活化FQR-DC-CIK细胞的杀肿瘤细胞活性
[0046]RPM1-1640培养基(上海恪敏生物科技有限公司)调整细胞浓度为I X 105/ml，分别接种于96孔细胞培养板，每孔100 μ 1，每板8孔，共三板；
[0047]每孔分别加入150ul 2X浓缩的FQR-DC-CIK细胞或2X浓缩的常规诱导的DC-CIK细胞，同时，按照1:10分别加入NK细胞敏感细胞株-K562细胞株(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)。每板的前四孔标识为FQR-DC-CIK细胞组、后四孔标识为常规诱导的DC-CIK细胞组；
[0048]置37°C、5% C02(V/V)培养箱中共同培养；
[0049]培养后用MTT法检测其0D570杀瘤活性；
[0050]黄芪提取物FQR-8诱导免疫细胞FQR-DC-CIK杀伤肿瘤细胞K562活性结果如(图3)所示。表明通过FQR-8诱导培养的DC-CIK细胞，杀瘤活性高于常规培养的DC-CIK细胞。[0051 ]《实施例4》FQR-DC-CIK细胞治疗荷瘤小鼠生存期检测
[0052]复苏小鼠黑色素瘤B16细胞株(上海通派生物技术有限公司)；
[0053]取C57小鼠(上海义森生物科技有限公司)脾脏，常规制备小鼠FQR-DC-CIK细胞和DC-CIK细胞；
[0054]C57小鼠腋下接种小鼠黑色素瘤B16细胞，每只注射约2.5 X 16个，共三十只，随机分为三组；
[0055]从第三天起每日腹腔注射诱导7天的FQR-DC-CIK细胞和DC-CIK细胞，共五次，每次每只注射I X 16个/0.5ml，空白对照组注射生理盐水0.5ml ；
[0056]观察并记录荷瘤小鼠的生存期，结果见(图4)，表明FQR-DC-CIK细胞可以延长荷瘤小鼠的生存期。
【主权项】
1.一种黄芪提取物FQR-8，其特征是，所述提取物是将熟黄芪粉碎成浆液，经纤维素酶30分钟后灭活，高速离心，上清液浓缩后再次离心；将其加入乙醇，4°C过夜，离心得到沉淀；用去离子水溶解沉淀后，大孔吸附树脂XAD-16柱进行吸附；水清洗后，依次用20%甲醇、40%甲醇、60%甲醇、80%甲醇、100%甲醇，4°C下以流速0.18?0.20cm/min进行洗脱，分别接收洗液；收集OD42-最大吸收值的组分，旋转蒸发、冷冻后，真空冷冻干燥获得白色粉末即为FQR-8。2.一种利用黄芪提取物FQR-8诱导DC-CIK的方法，其特征是，所述方法依次包括以下步骤: 外周血采集:无菌抽取肿瘤患者外周血，肝素钠抗凝并充分混匀，避免凝血； 肿瘤抗原的获取:室温离心沉淀外周血，收集上层血浆，灭活备用； 单个核细胞分离、收集:生理盐水稀释混匀所得细胞沉淀物，轻轻加至淋巴细胞分离液表面，在650g条件下离心；离心结束后，加入生理盐水，混匀混匀；室温离心沉淀，弃上清，生理盐水再次悬浮混匀，室温离心沉淀； FQR-DC-CIK细胞诱导培养:沉淀物用含黄芪提取物FQR-8的FQR-DC-CIK诱导培养基悬浮，并用白细胞稀释液稀释计数，置饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养，期间根据细胞的生长状况适时换液扩增，直至细胞数量达到实验所需。3.权利要求2所述的诱导方法，其特征是，FQR-DC-CIK细胞诱导培养液中，所用黄芪提取物FQR-8的浓度为0.0 lug/ml?lmg/ml。4.权利要求1所述黄芪提取物FQR-8在制备肿瘤细胞免疫治疗药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种黄芪提取物FQR-8及其制备和用途，并提供了FQR-8诱导培养CIK或DC-CIK细胞的方法，其包括外周血采集、肿瘤抗原获取、单个核细胞分离、洗涤、DC-CIK细胞的诱导、培养等步骤；本发明获得的黄芪提取物FQR-8，可以有效提高CIK细胞的增殖、提高DC-CIK细胞杀瘤活性、延长DC-CIK细胞治疗荷瘤小鼠的带瘤生存期。
【IPC分类】A61P35/00, A61K36/481, C12N5/0783, C12N5/0784
【公开号】CN105154404
【申请号】CN201510707389
【发明人】杨兆勇, 李霞, 许乐幸, 汪康游, 张志斐, 白利平, 张紫浓, 李亚东, 金媛媛
【申请人】东营凤起生物科技发展有限公司
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年10月27日