R仪上进行。
[0058]扩增体系为 25 ^以其中包括 10XPCRBuffer(Mg2+Plus)2yLdNTPMixture(各 2. 5mmol/L) 0. 3yLI3t2a/Bt2b(10ymol/L) 1yL模板DM(20ng/yL) 1. 0yLTaKaRa Taq巧U/yL) 0. 3yL，dd肥0 16. 9yL。
[0059] ?0?反应条件为：941：2111111，1个循环；94°(：153,551：3〇3,721：9〇3,30个循环； 72°ClOmin，1 个循环。
[0060] 扩增产物用质量分数为1. 5的琼脂糖凝胶、0. 5XTBE电泳缓冲液电泳分离，w ULTRA-URLETPRODUCTS凝胶成像系统记录分析电泳谱型。在紫外灯下快速切取小麦条诱菌 的特异性PCR条带，化深圳依诺金生物有限公司化tcherSpinGEK2050凝胶回收试剂盒回 收纯化，交上海生工技术公司双向测序。测序结果WNCBI的BasicLocalAlignmentSearch Tool进行序列拼接，得到特异性PCR片段的序列全长，继而WBLASTN程序与Gen2Bank、 EMBLWBJ、PDB中的序列进行同源性比对。
[0061] 实验结果：用引物化2a和化化组合对小麦条诱菌、叶诱菌和杆诱菌的曲NA进行 PCR扩增，意外地发现，该保守引物能够区分小麦条诱与叶诱和杆诱。目P，小麦条诱菌具有 长度为36化P的特异性DNA片段（SeqIDNo. 3)，而小麦叶诱菌和小麦杆诱菌具有长度为 495bp的特异性DNA片段（图6)。研究发现，小麦叶诱菌和小麦杆诱菌扩增出的DNA片段 (SeqIDNo. 4)同源性为100% (图7)，而小麦条诱菌与其同源性为31. 23% (图8)。
[0062] 实施例2、本发明所述试剂盒的制备 阳〇6引1.引物的获得
[0064] 根据实施例1获得的条诱菌特异性序列SeqIDNo. 3,利用软件Primer5. 0设计 一系列用于巧光定量PCR检测的引物。 阳0化]经过引物筛选和验证，最终获得本发明所述试剂盒中的所述特异性引物，其正反 向引物的核巧酸序列如下：
[0066] osgQ607/osgQ608 ：
[0067] GGATGCCTCGAAGGGTTATACC(SeqIDNo. 5)/TGCTAGATACAATGGCACATCTGA(SeqID No. 6)〇
[0068] 2.试剂盒组装
[0069] 将所述引物、2XSGPCRMasterMix、2XSGGreenqPCRMix(withROX)和双蒸水 按一定用量比例配合组装成本发明所述的试剂盒。
[0070] 实施例3、本发明所述试剂盒检测小麦样品
[0071]巧骤: 阳0巧 A.获取标准曲线
[0073] 1.DNA标准品的制备：按照质粒DNA提取试剂盒的操作说明提取条诱菌CY33菌株 的基因组DNA(质粒DNA)，并W质粒DNA为模板，加入引物osgQ607/osgQ608、普通PCR扩增 常用试剂（如表1)进行PCR扩增；所述PCR扩增的反应体系如表1所示；反应程序如表2 所示；扩增出的条诱菌PCR产物即为DNA标准品。
[0074] 表 1 阳0巧]
[0079] 2.用分光光度计测定上述PCR产物的浓度为498ng/y1，按十分之一比例进行梯 度稀释成系列DNA标准品稀释液，并根据梯度浓度及PCR产物分子量分别计算出系列稀释 液的拷贝数浓度（copies/y1)。
[0080] 3.对上述系列DM标准品稀释液进行巧光定量PCR扩增，所述扩增体系如表3所 示，扩增反应程序如表4所示，正反向引物：osgQ607/osgQ608。 W81]表 3[0082]
阳0化]4.利用定量PCR仪的自带软件设定阔值。
[0086] 5.收集巧光定量PCR扩增系列DNA标准品稀释液的产物的巧光信号，根据所述阔 值确定系列DNA标准品稀释液的系列Ct值。
[0087] 6.W上述系列Ct值为纵坐标，系列DNA标准品稀释液的拷贝数浓度（copies/ yl)为横坐标，绘制标准曲线。
[008引 B. 28份小麦待测样品的检测
[0089] 小素样品的化理：
[0090] 采用条诱菌CY33侵染小麦的叶片，并分别在处理比，2h，化，5h，化，7h，化，1化， 24h时进行取样，每个时段的叶片样品分别做3个平行重复；同时对未被侵染的小麦叶片也 进行取样作为阴性对照。
[0091]小素样品的粉?测：
[00巧1.利用植物基因组DNA提取试剂盒分别对上述小麦待测样品共28份进行曲NA提 取，小麦样品编号与处理时长的对应关系详见表5。利用分光光度计分别测定28份曲NA的 初始浓度，同时将所有28份曲NA统一稀释成一致的检测浓度10化g/y1。
[009引2.利用本发明所述试剂盒对28份检测浓度为10化g/y1的曲NA分别进行巧光定 量PCR扩增，所述扩增体系如表5所示，扩增反应程序如表4所示；每个样品做3个平行反 应。
[0094]表 5阳0巧]
[0096] 3.收集巧光定量PCR扩增产物的信号，根据阔值对应的Ct值代入标准曲线可获 得每微升曲NA样品中含有条诱菌的拷贝数，通过检测浓度和体积的换算还可W得出Ing曲NA样品中含有的条诱菌的拷贝数。 阳〇巧]结果: 阳〇9引 A.标准曲线
[0099] 系列DNA标准稀释液经巧光定量PCR扩增后获得如图1所示的扩增曲线，阔 值被设定为11426. 020655 ;根据所述扩增曲线，找出所述阔值下对应的循环数即Ct值； PCR产物的分子量丽为：8化P;系列DNA标准品稀释液的梯度浓度、拷贝数浓度X和Ct 值的对应关系如表6,由此获得的标准曲线如图3所示，对应的直线回归方程式1为Ct =-3. 4791og(X)+43. 755〇
[0100] 表 6 [01011
阳102]B.待测样品检测结果
[010引28份待测小麦样品的曲NA浓度、分别代入标准曲线获得的每y1样品中含有的条 诱菌拷贝数化及每ng样品中含有的条诱菌拷贝数统计结果详见表7。 阳104]表7阳1化]
阳107] 由上述表7可知，利用本发明所述的试剂盒可W准确计算出小麦样品中处于潜育 期各时段的条诱菌的准确侵染菌量；从表中的数据可W看出，同时段的平行重复的样品之 间的菌量差异不大，较为准确。并且本发明试剂盒能检测出的最低菌量为每ng提自待测小 麦样品的DNA中含有2. 92个拷贝的条诱菌，证实了本发明提供的试剂盒具有检出限低、灵 敏度高、准确性好等优点。
[0108] 实施例4本发明所述试剂盒的质量控制
[0109] 本发明分别通过普通PCR和Real-time PCR对该引物的特异性和灵敏性进行了验 证。 阳110]巧骤: 阳11UA.普通PCR检测
[0112] 详细步骤参见实施例3"步骤"部分A部分中的第1步。 阳11引B.巧光定量PCR检测
[0114] 详细步骤参见实施例3的"步骤"部分B。 。"引结果:
[0116] (1)采用所述引物对小麦条诱菌进行普通PCR检测，可稳定扩增出82bp的目标条 带，而在阴性对照的小麦叶片中扩增不出任何条带；并且所述引物只能在条诱菌中扩增出 条带，而在条诱菌的近似菌种，例如叶诱菌、杆诱菌中扩增不出条带的，说明所述引物用于 普通PCR扩增条诱菌具有很高的特异性，见图9 ;无论是条诱菌DNA标准品还是小麦待测样 品DNA，利用所述引物对上述DNA经Real-time PCR获得的烙解曲线均显示为单一产物峰 (如图2和图5)，无引物二聚体等非特异性产物干扰，说明在利用巧光定量PCR检测条诱菌 方面，本发明所述引物同样具有较高的特异性。
[0117] (2)使用本发明所述引物用于普通PCR和Real-time巧光定量PCR分别检测小麦 条诱菌，其灵敏度高，检出限低，普通PCR的最低检出限为lOpg，而Real-time巧光定量PCR 的最低检出限为Ifg。 阳11引做利用曲NA的普通PCR产物获得标准曲线的定量PCR的扩增效率为94%，表明 利用本发明所述试剂盒的引物进行实时定量PCR扩增的扩增效率较高。
【主权项】
1. 用于定量检测小麦条锈菌的试剂盒，包括荧光定量PCR扩增的常规试剂，其特征在 于，还包括检测条锈菌的引物；所述引物的正向和反向的核苷酸序列如下： osgQ607/osgQ608 ： GGATGCCTCGAAGGGTTATACC/TGCTAGATACAATGGCACATCTGA。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其中所述荧光定量PCR扩增的常规试剂包括：2XSG PCRMasterMix和 / 或 2XSGGreenqPCRMix，以及双蒸水。3. -种定量检测小麦条锈菌的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 获取标准曲线方程： 所述标准曲线方程是以系列DNA标准品的梯度拷贝数浓度为横坐标，以采用引物osgQ607/osgQ608对所述系列DNA标准品分别进行荧光定量PCR扩增所得的Ct值为纵坐标 绘制的标准曲线拟合得出的方程； (2) 采用引物osgQ607/osgQ608对提取自待测样品的gDNA的普通PCR扩增产物进行荧 光定量PCR扩增； (3) 收集待测样品DNA的荧光定量PCR扩增的荧光信号，确定待测样品DNA的Ct值； (4) 将待测样品DNA的Ct值代入所述标准曲线方程获得待测样品DNA的拷贝数浓度； 所述DNA标准品为条锈菌基因组DNA的普通PCR扩增产物；所述待测样品为 小麦gDNA;所述引物osgQ607/osgQ608 的序列如下：GGATGCCTCGAAGGGTTATACC/TGCTAGATACAATGGCACATCTGA。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述荧光定量PCR扩增的反应体系为：2XSG GreenqPCRMix:0.5yl/yl，所述引物正向和反向各为：0.25yM，普通PCR扩增产物： 0.05y1/y1，其余为双蒸水。5. 根据权利要求3或4所述的方法，其中所述荧光定量PCR扩增的反应程序为：95°C 预变性10分钟；95°C变性20秒，60°C退火延伸30秒，45个循环。6. 根据权利要求3所述的方法，其中所述普通PCR扩增是指以gDNA为模板，用所述 引物〇sgQ607/osgQ608进行的普通PCR扩增反应；所述普通PCR扩增的反应体系为：2XSG PCRMasterMix:0.5yl/yl，所述引物正向和反向各为：0.25yM，普通PCR扩增产物： 0. 05y1/y1，其余为双蒸水；反应程序为：94°C预变性10分钟；94°C变性20秒，60°C退火 延伸30秒，40个循环。
【专利摘要】本发明提供了一种小麦条锈菌的定量检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括荧光定量PCR扩增的常规试剂，其特征在于，还包括检测条锈菌的引物；所述引物的正向和反向的核苷酸序列如下：osgQ607/osgQ608：GGATGCCTCGAAGGGTTATACC/TGCTAGATACAATGGCACATCTGA。本发明还公开了利用所述试剂盒定量检测小麦中条锈菌拷贝数的方法。本发明提供的试剂盒和方法能相对准确地定量测定小麦条锈菌在潜育状态下的侵染量，具有检出限低、灵敏度好、特异性强、扩增效率高等特点，为早期预测和防治小麦条锈病提供了一种可靠的检测手段。
【IPC分类】C12R1/645, C12Q1/68, C12Q1/04
【公开号】CN105200122
【申请号】CN201510386362
【发明人】高利, 蔚慧欣, 陈万权, 刘太国, 刘博
【申请人】中国农业科学院植物保护研究所
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2015年6月30日