通道的宽度和深度时主要是通道的上下壁表面)聚集。因此，细菌可以实质上以在细胞壁上的单层的形式分布。
[0070]图12显示示出在细菌形成单层的状态下在不同浓度的抗生素的存在下细菌物种的生长的图像。细菌在小于MIC的浓度(对照和0.06 μ g/mL)时分裂，而在大于MIC的浓度(0.5 μ g/mL)时仅以丝状形式生长。从这些观察可以确定MIC。图13显示示出在小于MIC的浓度(对照和0.06 μ g/mL)和大于MIC的浓度(0.25和0.5 μ g/mL)的作为β -内酰胺抗生素的氨曲南的存在下铜绿色假单胞菌(P.aeruginosa)菌株的生长的图像。细菌在小于MIC时分裂而以丝状形式而生长，而在大于MIC时仅以丝状形式生长。可以通过观察在单层图像中的细菌分裂而确定MIC。
[0071]根据本发明，可以通过单个聚焦单层成像和3D成像而观察细胞。S卩，当将细菌细胞和作为胶凝剂的琼脂糖的混合物引入各通道时，可以在MAC芯片的底板和琼脂糖之间的界面处观察到单层形式的细胞，并且可以在3D培养后在其他部分观察。
[0072]同时，通过一个入口连续地添加细菌细胞和胶凝剂(琼脂糖)引起形成细菌的单层，其可以通过单聚焦成像观察。
[0073]此外，使用根据本发明的细胞培养测试装置能够通过成像观察双重感染。
[0074]图14和15是显示不使用抗生素时的两种细菌菌株和对抗生素具有抗性的两种细菌菌株的生长的光学显微镜图像，揭示了可以测定被细菌菌株的双重感染。
[0075]试验条件如下:
[0076]* 菌株
[0077]-大肠杆菌ATCC25922(杆状菌株)
[0078]-粪肠球菌ATCC29212(球形菌株)
[0079]*抗生素
[0080]-庆大霉素(浓度:32μ g/mL)
[0081]MIC处在两种菌株的易感范围内
[0082]-红霉素(浓度:8μ g/mL)
[0083]仅对粪肠球菌ATCC 29212易感
[0084]-对照
[0085]*温育时间:3h
[0086]*菌株浓度
[0087]-McFarland 0.25
[0088]*琼脂糖浓度:2%
[0089]*使用10X倍透镜进行观察
[0090]细菌的形状在O小时图像中难以辨别，并且不能监视，直到经过4小时后细菌分裂至一定程度。此时，确认了杆状细菌和球形细菌的共存。还可以确认是否发生被细菌双重感染。
[0091]图16是显示使用根据本发明的一个实施方式的细胞培养测试装置对哺乳动物细胞进行3D培养的图。对于该试验，将哺乳动物细胞和ECM (胶原蛋白、基质胶、纤维蛋白、琼脂糖等)的混合物引入通道中。ECM胶凝后，注入培养基或药物。结果，细胞由于培养基供应的营养物质而生成。作为选择，细胞被药物杀死。在此类环境下，细菌以三维(即以3D培养)方式生长。
[0092]图17显示使用MAC芯片通过单个细胞形态分析(SCMA)测定的4种临床菌株物种的MIC值。从Seung-ok Lee教授(韩国天主教大学仁川St.Mary医院诊断医学科)处获得来自约40个患者的4种菌株，包括大肠杆菌、粪肠球菌、铜绿色假单胞菌和金黄色葡萄球菌(S.aureus)。对于显微镜使用60 X物镜(对于大肠杆菌为40 X透镜)。在Mc = 0.5时，将各个菌株与琼脂糖混合。观察到在底部形成单层。MIC值可以使用MAC芯片在4小时内获得。参见图17，使用MAC芯片测定的MIC值很好地符合通过临床和实验室标准协会(CLSI)定义的MIC范围(S卩，品质控制范围)。因此，可以认为使用MAC芯片进行的单个细胞形态分析是非常快速精确的AST检验。
[0093]虽然已经参照附图和实施方式详细地描述本发明，本领域技术人员会意识到可以对实施方式进行各种改变和修改而无需背离如所附权利要求公开的本发明的主旨。
【主权项】
1.一种微流体多孔型细胞培养测试装置，其具有多个对齐的微流体孔单元的阵列结构，每个微流体孔单元包含第一流体穿过其进入的入口、适于在其中收容第二流体的收容室、第一流体流动经过其中的微流体通道和适于促进第一流体的进入的空气出口，其中所述微流体通道与所述入口和所述空气出口连通从而使所述第一流体能流入并填充所述微流体通道，其中所述收容室设计为孔的形式以便保持进入的第二流体，并且在其中所述收容室的下方侧面部与所述微流体通道的侧面部连通之处形成毛细管阀，从而使所述第一流体和所述第二流体彼此相遇而形成界面。2.如权利要求1所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述微流体孔单元的尺寸与市售多孔板的各个孔的尺寸一致。3.如权利要求2所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述孔布置成1X1、1X2、1X4、2X4、4X6、12X8、24X16 或 48X32 的矩阵。4.如权利要求1所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述微流体通道布置成围绕所述收容室以使所述微流体孔单元具有四边形结构。5.如权利要求1所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述毛细管阀具有预定厚度和宽度以防止所述第一流体进入所述收容室。6.如权利要求5所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述毛细管阀的厚度由所述微流体通道的厚度所限定。7.如权利要求5所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述毛细管阀的厚度为100 μ m ?500 μ m，宽度为 500 μ m ?2mm。8.如权利要求1所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述空气出口形成在所述微流体通道的一端，与所述微流体通道的上壁连通，并暴露至空气。9.如权利要求1所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述第一流体是含胶凝剂液体介质和生物试剂的混合溶液，并且所述第二流体是含有生理活性物质的溶液。10.如权利要求1所述的多孔型细胞培养测试装置，其中所述细胞培养测试装置的主体由透明材料制成。11.一种使用微流体多孔型细胞培养测试装置的细胞分析方法，所述微流体多孔型细胞培养测试装置具有多个对齐的微流体孔单元的阵列结构，每个微流体孔单元包含让含胶凝剂液体介质和生物试剂的混合溶液穿过其进入的入口、适于在其中收容生理活性物质的收容室、与所述入口连通并且所述液体介质流动经过其中的微流体通道以及所述微流体通道的下方侧面部通过其与所述收容室的侧面部连通的毛细管阀，所述方法包括下述步骤: (a)向所述入口引入所述含胶凝剂液体介质和所述生物试剂的混合溶液，以在所述微流体通道中填充所述混合溶液，并使所述混合溶液胶凝而形成固体薄膜； (b)将所述生理活性物质供应至所述收容室中，并使所述生理活性物质通过所述毛细管阀扩散至所述固体薄膜中；和 (C)在单个细胞基础上，观察在所述混合溶液和所述生理活性物质彼此相遇的界面处发生的生物试剂的变化。12.如权利要求11所述的细胞分析方法，其中步骤(a)包括: (a-Ι)将含有所述生物试剂的溶液引入所述入口以填充所述微流体通道的一部分，和 (a-2)进一步将所述含胶凝剂液体介质引入所述入口以使所述液体介质形成层流并且填充所述微流体通道，从而在所述微流体通道的上壁表面和下壁表面上形成所述生物试剂的单层。13.如权利要求11所述的细胞分析方法，其中所述方法还包括步骤(d):在单个细胞基础上观察所述生物试剂对所述生理活性物质的响应，以确定所述生理活性物质的最小抑制浓度(MIC)或最小生物膜清除浓度(MBEC)。
【专利摘要】提供了一种微流体多孔型细胞培养测试装置，其中所述多孔型细胞培养测试装置具有多个对齐的微流体孔单元的阵列结构，且所述微流体孔单元包含注入第一流体的注入部、适于在其中收容第二流体的收容部、第一流体流动通过其中的微流体通道和适于促进第一流体的进入的空气排出部。
【IPC分类】C12M1/18, C12M3/00
【公开号】CN105209595
【申请号】CN201480024477
【发明人】郑勇均, 金殷勤, 权圣勋, 崔祯日
【申请人】昆塔麦特利斯株式会社, 首尔大学校产学协力团
【公开日】2015年12月30日
【申请日】2014年5月2日
【公告号】EP2987851A1, US20160075985, WO2014178692A1