制备用于预防或治疗抗 肿瘤的制剂中应用。具体的，所述肿瘤可W是头颈部肿瘤等。
[0029] 本发明提供的技术方案具有如下有益效果：
[0030] 本发明提供的培养方法制得的iCIK细胞较传统细胞培养方法相比，其可获得较 高比例的NK细胞和NKT细胞，细胞数量可达到100亿个左右。 阳03U 将本发明培养制得的iCIK细胞应用于HNSCC患者的治疗，发现和仅采用化疗的 治疗组相比，将化疗和iCIK细胞注射结合的治疗组，其无进展生存时间（PF巧和总生存期 (0巧均明显高于仅采用化疗的治疗组。将本发明培养制得的iCIK细胞应用于HNSCC患者 的治疗，通过和化疗结合，具有很好的协同效应，可有效改善因化疗造成的全身免疫抑制， 诱发肿瘤退化。可见，采用本发明培养方法制备的免疫细胞（iCIK细胞）在肿瘤治疗方面 具有很好的疗效，为肿瘤治疗可提供了一种新的辅助治疗手段，有助于延长HNSCC患者存 活期，改善全身免疫抑制。
【附图说明】
[0032] 图IA为治疗方案示意图；图IB为分组方法示意图；
[003引图2中，图A、B均为ACT治疗组的患者化疗前的肿瘤组织切片的肥染色图；图C为ACT治疗组的患者动脉造影图；图D、E分别为ACT治疗组的患者在化疗后、iCIK细胞注 射治疗后的肿瘤组织切片肥染色图；图F为ACT治疗组的患者在iCIK细胞注射治疗后的 图片；
[0034] 图3A、图3B分别为无进展生存期（PF巧和总生存期（0巧的Kaplan-Meier生存曲 线；
[0035] 图4中A、B图分别为实验组患者在化疗前、化疗后、注射iCIK细胞后的外周血中 分别分离的单核细胞按照实施例2的方法培养得到的免疫细胞的细胞毒性、细胞增殖能力 检测结果；
[0036] 图4中C、D图为实验组患者在化疗前、化疗后、注射iCIK细胞后的外周血中分别 分离的单核细胞按照实施例2的方法培养得到的免疫细胞的表型分析结果；图4中E、F图 为采用流式细胞术对实验组患者在化疗前、化疗后、注射iCIK细胞后的外周血进行表型分 析的结果；
[0037]图 4 各图中的pre-chemotherapy、post-chemotherapy、ACT的结果分别对应于化 疗前、化疗后、注射iCIK细胞后。 阳03引 图5,iCIK和CIK细胞增殖数量比较。
[0039] 图6,患者周某iCIK和CIK细胞亚型流式细胞检测结果。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合附图对本发明的技术方案做进一步说明： 阳OW 实施例1
[0042] 一种用于免疫细胞培养的试剂盒，该试剂盒包括培养液A和包被液。
[0043] 其中，培养液A按照如下方法配制：将rhIFN-丫、rh比-2、rhIL-15和人转铁蛋白加 入无血清淋己细胞培养液中混匀而成，其中，所用的无血清淋己细胞培养液具体为邸M561 培养基（TaKaRa公司，日本）；rhIFN-丫（商品名为克隆伽玛）、rhlk2(北京双鸾药业股份 有限公司）、rhlkl5和人转铁蛋白（Sigma公司，美国）在培养液A中的终浓度依次分别 为lOOOU/mL、1000U/mL、5ng/mL、5ug/ml。 W44] 包被液按照如下方法配制：将0KT3抗体和Retronectin加入PBS缓冲液中混匀而 成。其中，0KT3抗体（杨森制药公司，日本）和RetronectinCTaKaRa公司，日本）在包被 液中的终浓度均为l(K)ng/mL。 W45] 实施例2
[0046] 一种免疫细胞培养方法，按照如下步骤进行：
[0047] 1)采用Ficoll-Hypaque密度梯度离屯、法，从尚未进行化疗的头颈部肿瘤病人的 外周血中分离出单核细胞（PBMC);
[0048] 2)将步骤1)的单核细胞接种于经实施例1的包被液包被处理的培养瓶中，用激活 培养基进行培养，于37 °C、5 %C〇2的细胞培养箱内培养4天；其中，所用的激活培养基为向 实施例1的培养液A中添加该头颈部肿瘤病人的血浆（自体血浆）制得，该血浆在该激活 培养基中的质量百分比为2%;
[0049] 3)将经步骤2)培养的细胞转移至大培养瓶或培养袋，用实施例1中的培养液A继 续培养，在培养过程中，每隔2~3天更换一次该培养液A。
[0050] 4)细胞的总培养时间为15天，培养结束后细胞数量达到100亿个W上，收集细胞 群。
[0051] 经检验无微生物污染后制成免疫细胞治疗制品，可用于病人自体回输的抗肿瘤治 疗。
[0052] 该培养方法培养获得的免疫细胞将其称为iCIK细胞（improving c^okine-in化cedkillercells,改良的CIK细胞）。步骤1)中的单核细胞也可W通过从 离体的肿瘤病人淋己结、腹水、胸水或肿瘤组织中分离获得。 阳〇5引应用例1
[0054] 下面对按照本发明的培养方法培养获得的iCIK免疫细胞（改良的CIK细胞）应 用于HNSCC病人的治疗进行介绍如下： 阳化5] 3. 1实验设计
[0056] 3. 11病人入洗_ :(1)年龄在18~75周岁；似处于治疗初期阶段；做ECOG评分 《2,预期寿命> 12周；(4)未进行放射治疗；（5)中性粒细胞数> 2*109/1，血小板数> 100*1〇7l;(6)具备功能性的肝、肾、屯、血管系统；若病人存在中枢神经系统转移、或未被控 制的感染、或对生命产生严重威胁的潜在疾病、或处于孕期或哺乳期，则不在入选范围。
[0057] 3. 12分组（分组方法化图1B):
[0058] 对照组（化疗组）---共入选22位HNSCC患者，对对照组患者仅进行化疗，在第一 天静脉滴注120mg紫杉醇（Paclitaxel)、120mg顺销（Cisplatin)，在第1~5天持续静脉 滴注1200mg氣尿喀晚巧-即）或16mgPYM。
[0059] 实验组（ACT治疗组）---共入选21位HNSCC患者，实验组为化疗结合iCIK细胞 注射治疗，其治疗方案见图1A，即，在病人进行化疗前从其外周血中分离出单核细胞，然后 按照和对照组相同的治疗方式进行化疗，在此期间对分离出的单核细胞进行体外培养，具 体按照实施例2的方法进行培养并获得免疫细胞iCIK细胞；在化疗完成后，向病人静脉输 注1~1. 9X1〇1°个iCIK细胞，每隔1个星期输注1次，共输注两次。对于患有上颂窦鱗癌 的病人采用动脉注射（可参见图2中C图所示）。最后，进行根治性切除。
[0060] 入组患者情况可参见表1所示。
[0061] 表1病人一般临床资料
[0062]
W64] 3. 2 结果 阳O化]3. 2. 1治疗效果
[0066] 对ACT治疗组诊断患有上颂窦鱗癌的患者在化疗前、化疗后、及注射iCIK细胞后 的肿瘤组织切片进行染色比较。其中图2中A、B图为患者化疗前的活体组织切片的肥染 色图，从图2中A、B图可见，其中有大量的非典型细胞，形成多重癌巢，且只有很少量的淋己 细胞浸润。对化疗后、及iCIK细胞注射治疗后的肿瘤活体组织切片进行HE染色，其结果分 别可见图2中D、E图，从图中可见，患者经iCIK细胞注射治疗后，有更多的淋己细胞渗透到 肿瘤中，肿瘤细胞被其周围的T细胞所杀死，患者其肿瘤大小得到明显减少（可见图2中F 图）。可见，ACT治疗组的患者经治疗后其肿瘤得W缩小，该患者其后续的根治性切除手术 非常成功。可见，在化疗后进行iCIK细胞注射治疗，可有效提高功能保全手术的可行性。
[0067] 对患者进行治疗后随访（平均随访时长为4年），发现实验组相比于对照组，实 验组患者具有更佳的总生存期、和复原效果。实验组的中位OS值和PFS值分别为58个 月、56个月，而对照组分别为45个月、40个月。对于OS值和PFS值达到3年的概率，实 验组分别为81%、76%，对照组分别为56%、50%。结果可参见图3A、图3B，及表2。采用 RECIST(responseevaluationcriteriainsolidtumors)评价实验组和对照组的客观反 应率0RR，结果见表2。从表2可见，实验组的治疗疗效不是暂时的，而是可持续维持的。
[0068] 表2治疗有效性评价
[0071] 3. 2. 2不良巧麻
[0072] 与治疗相关的不良反应见表3所示，可见，实验组其不良反应均属低级别，且和现 有的化疗中采用紫杉醇、PYM、氣尿喀晚治疗时的副作用一致，且和对照组相比，实验组发生 骨髓细胞减少的病例更少，且未发现主要器官的功能异常。
[0073] 表3治疗副作用及并发症评价
阳0巧]3. 2. 3细胸毒忡评价及细胸蜡裙能力
[0076] 对实验组患者在化疗前、化疗后、注射iCIK细胞后的外周血中分别分离的单核细 胞按照实施例2步骤2)~4)培养得到的免疫细胞进行细胞毒性、细胞增殖能力评价，结果 分别见图4中A图、B图。
[0077] 所采用的细胞株：人舌癌细胞SCC-25,来自格里菲斯大学ESKITIS研究所；人 白血病细胞株K562,来自中山大学肿瘤中屯、；SCC-25和K562分别用DMEM(Sigma,USA)、 RPMI1640 (Gib