co,USA)培养基培养，并在培养基中添加10 %FBS(Gibco,USA)、2mM左旋谷酷 胺（Sigma,USA)、50Jig/mL庆大霉素（Sigma,USA)。 阳〇7引细胞毒性实验：效应细胞（iCIK细胞）和祀细胞（SCC-25或K562)比为10:1， 采用非放射性细胞毒性检测试剂盒切toTox96-wellNon-Radioactive切totoxicity Assay(Promega,USA)按照其说明书检测细胞毒性。
[0079] 结果参见图4中A图，从图4中A图可见，由化疗后患者的外周血单核细胞培养 得到的iCIK细胞，其对SCC-25或K562的细胞毒性都明显逊于化疗前、及iCIK细胞注射 治疗后；而进一步经iCIK细胞注射治疗后患者的外周血单核细胞培养得到的iCIK细胞对 SCC-25或K562的细胞毒性都得到增强，甚至细胞毒性高于化疗前。
[0080] 图4中B图为对iCIK细胞增殖能力的考察结果，从该图中可见，化疗后患者的外 周血单核细胞培养得到的iCIK细胞增殖能力最差，而进一步经iCIK细胞注射治疗后患者 的外周血单核细胞培养得到的iCIK细胞增殖能力强于化疗前和化疗后，可见，HNSCC病人 在化疗后采用iCIK细胞注射治疗，iCIK细胞增殖能力得到修复。
[0081] 3. 2. 4免巧学分析
[0082] 对实验组患者在化疗前、化疗后、注射iCIK细胞后的外周血中分别分离的单核细 胞按照实施例2步骤2)~4)培养得到的免疫细胞进行免疫学分析。
[0083] 实验方法：将约IX1〇6个按照实施例2的方法培养得到的免疫细胞重悬于 20yLPBS(含有 2 %FBS和 1 %Nar^)中，并与 10yLCD3-門TC/CD56-RPE、CD3-門TC、 CD4-RPEXD8-R阳抗体在4°C解育30min。然后用PBS洗涂细胞2次，用Iml染色缓冲液度D 化armingen)重悬，采用流式细胞仪分析细胞群，采用多细胞因子检测试剂盒HumanThl/ Th2CytokinesMulti-AnalyteELISArray?Kit(SABiosciences)Rrederick,MD)检测Hil/ Th2细胞因子分泌水平。
[0084] 结果参见图4中的图C~F。从图4中的图C-D可见，与化疗后相比，注射iCIK 细胞后的外周血单核细胞培养得到的iCIK细胞其CD3+CD8+T细胞百分比和Thl细胞因子 (IL-2、IFN-丫）的分泌均明显增加；从图4中图E可见，采用流式细胞术对患者外周血进行 表型分析，发现和化疗前相比，化疗后病人的外周血中含有的CD3+CD4+和CD4+CD25+T细胞 的比例明显减少，但是CD3+、CD3+CD8巧细胞的比例有所提高；从图4中图F可见，化疗后患 者外周血中分泌的Thl细胞因子（IL-2,IFN-丫，TNF-a)明显降低，但是经后续采用iCIK 细胞注射治疗后，Thl细胞因子（比-2,IFN-丫，TNF-a)分泌明显增加。
[00化]由上述实验结果可见，病人化疗前的外周血中分离的单核细胞采用本发明的方法 培养获得的免疫细胞（iCIK细胞）用于HNSCC患者的治疗，特别是在化疗后向患者注射该 iCIK细胞进行治疗，其可W对化疗造成的免疫抑制、及免疫细胞对癌细胞毒性弱化等产生 很好的改善作用，且并发症少。
[0086] 经本发明方法培养获得的iCIK细胞具有自然杀伤细胞及活化T细胞的特性。本 发明制备的免疫细胞（iCIK细胞）和化疗药物互相搭配，可发挥很好的协同效应；在治疗癌 症时，化疗造成的白细胞减少的副作用，可W通过后续进行输注免疫细胞（iCIK细胞）得到 减轻。
[0087] 对比例
[0088] 一种CIK细胞培养方法，其和实施例2的培养方法相比，步骤基本相同，对于相同 之处不再寶述，下面对其和实施例2的不同之处进行说明：该对比例和实施例2中所用的包 被液和培养液A不同，该对比例包被液中未添加Retronectin,且该对比例中对应于培养液 A的培养液中未添加人转铁蛋白和rhIL-15。
[0089] 按照对比例培养获得的免疫细胞称之为CIK细胞，下面对按照本发明实施例2的 培养方法培养获得的iCIK细胞（改良的CIK细胞）和对比例获得的CIK细胞的细胞亚型 比较介绍如下：
[0090] 对本发明实施例2及对比例的培养方法培养细胞的第1~6天期间每日计数如图 5所示（图5的结果为按照实施例2和对比例的培养方法由HNSCC患者周某的外周血中分 离的单核细胞培养获得的免疫细胞增殖数量结果），培养第六天本发明实施例2的方法获 得的iCIK细胞数是对比例获得的CIK细胞数的8. 3倍。
[0091] 培养第13天采用流式细胞术作淋己细胞亚型分析，如图6显示（图6的结果为按 照实施例2和对比例的培养方法由HNSCC患者周某的外周血中分离的单核细胞培养获得 的免疫细胞的细胞亚型检测结果。），本发明实施例2的方法培养获得的细胞群，其NK和 NKT细胞分别为41. 8%和17. 43%，而对比例获得的细胞群中NK细胞为0.92%、NKT细胞 为 4. 74%。
[0092] W上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故 凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对W上实施例所做的任何简单修 改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。
【主权项】
1. 一种用于免疫细胞培养的试剂盒，其特征在于，包括培养液A，所述培养液A通过向 无血清淋巴细胞培养液中加入rhIFN-y、rhIL-2、rhIL-15和人转铁蛋白制得。2. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述rhIFN- 丫、rhIL-2、rhIL-15和人转 铁蛋白在所述培养液A中的终浓度依次分别为500-1000U/mL、500-5000U/mL、5-50ng/mL、 5_30ug/ml。3. 根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括包被液，所述包被液 为向PBS缓冲液或无血清淋巴细胞培养液中加入0KT3抗体和Retronectin制得，所述0KT3 抗体和Retronectin在包被液中的终浓度均为50_200ng/mL。4. 根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，无血清淋巴细胞培养液为RPMI1640、 CytoRola301 或KBM561 培养基。5. -种免疫细胞培养方法，其特征在于，包括如下步骤： 1) 从离体的肿瘤病人的外周血、淋巴结、腹水、胸水或肿瘤组织中分离出单核细胞； 2) 将步骤1)中的单核细胞接种于激活培养基中，于包被液处理过的培养容器中培养 3~5天；所述激活培养基为向培养液A中添加所述肿瘤病人的血浆制得，所述培养液A通 过向无血清淋巴细胞培养液中加入rhIFN-y、rhIL-2、rhIL-15和人转铁蛋白制得；所述包 被液为向PBS缓冲液或无血清淋巴细胞培养液中加入0KT3抗体和Retronectin制得； 3) 将经步骤2)培养的细胞转移至另一扩增培养容器中用培养液A继续培养，每隔2~ 3天更换1次所述培养液A。6. 根据权利要求5所述的免疫细胞培养方法，其特征在于，rhIFN-y、rhIL-2、rhIL-15 和人转铁蛋白在所述培养液A中的浓度依次分别为500-1000U/mL、500-5000U/mL、5-50ng/ ml、5_30ug/ml;所述0KT3抗体和Retronectin在包被液中的终浓度均为50-200ng/mL;所 述血浆在激活培养基中的质量百分比为0. 5~10%。7. 根据权利要求5所述的免疫细胞培养方法，其特征在于，所述无血清淋巴细胞培养 液为RPMI1640培养基、CytoRola301培养基或KBM561培养基。8. 根据权利要求5所述的免疫细胞培养方法，其特征在于，细胞的总培养时间为9~ 25天；和/或，步骤1)为从离体的尚未进行化疗的肿瘤病人的外周血、淋巴结、腹水、胸水 或肿瘤组织中分离出单核细胞。9. 采用权利要求5~8任一项所述的免疫细胞培养方法获得的免疫细胞在制备用于预 防或治疗肿瘤的制剂中的应用。10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为头颈部肿瘤。
【专利摘要】本发明提供一种用于免疫细胞培养的试剂盒，同时还提供采用该试剂盒培养免疫细胞的方法，及采用该免疫细胞培养方法获得的免疫细胞在制备用于预防或治疗肿瘤的制剂中的应用。本发明提供的试剂盒包括培养液A，所述培养液A为向无血清淋巴细胞培养液中加入rhIFN-γ、rhIL-2、rhIL-15和人转铁蛋白制得。采用本发明方法培养得到的免疫细胞，细胞数量可达100亿个细胞数左右，除了CTL细胞群外，还含有较多的NK细胞和NKT细胞群。本发明的培养方法制得的免疫细胞应用于HNSCC治疗中，可以改善因化疗而造成的免疫抑制，延长病人生存期。
【IPC分类】C12N5/078, A61K35/17, A61P35/00, C12N5/0786
【公开号】CN105219708
【申请号】CN201510430773
【发明人】汪华, 蒋盼, 张雁, 张海霞
【申请人】中山大学, 广州一代医药科技有限公司
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年7月21日