/L的母液，然后分别取5 yL外引物1、5 yL外引物2、40 yL内引物1、40 yL内引物2、5 yL环引物，充分混匀，配成100 yL的LAMP检测弓I物溶液，其中引物序列分别为:
外引物 I:TATGCCGCCGGTGACG (SEQ ID NO:1);
外引物 2:CCATCCGTGTGCCTGCA (SEQ ID NO:2);
内引物 1:ATCGACGGCGTTGGTCCGG-GGTGGAATCCGCTCTTCAC (SEQ ID NO:3);
内引物 2:ATCCACGTAGCCGAACGCATCG-GCCCGAACTGGTCAGACC (SEQ ID NO:4);
环引物:TGCTCCACCCGCATCGA (SEQ ID NO:5)；
(2)Bst DNA聚合酶，浓度为8 U/μ L，分装100 μ L放入一个新的1.5 mL离心管中；
(3)1X 反应缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8),100 mmol/L KCl, 100 mmol/L (NH4)2SO4,80 mmol/L MgSO4,8 mol/L 甜菜碱，分装 250 μ L 放入一个新的 1.5 mL 离心管中；
(4)dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP, dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成，分装500 μ L放入一个新的1.5 mL离心管中；
(5)显色剂:1000XSYBRGREEN I荧光染料，分装200 μ L放入一个新的棕色1.5 mL
离心管中。
[0021]用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测:
(1)提取番茄溃疡病菌基因组DNA:按细菌基因组DNA提取试剂盒提取番茄溃疡病菌基因组DNA ；
(2)配制待测样品的LAMP检测反应体系:在200μ L反应管内加入模板DNA 2~5 μ L、检测引物溶液I μ L、Bst DNA聚合酶I yL、10X反应缓冲液2.5 μ UdNTPs溶液2~5 μ L，用灭菌去离子水或超纯水补齐至总体积为25 μ L ;
(3)运行LAMP扩增反应:63°C孵育30~60min，80°C孵育5min终止反应；
(4)LAMP扩增结果的鉴定:在反应管中加入1~2μ L显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。
[0022]实施例2试剂盒及检测方法的特异性实验。
[0023]对实施例1所述的试剂盒及其检测方法的特异性进行实验，测试样品包括:番茄溃疡病菌、番茄青枯假单胞菌、茄青枯假单胞菌、马铃薯环腐病菌、黄瓜角斑病菌、西瓜果斑病菌、马铃薯疮痂病菌。
[0024]本实施例中，仅含番茄溃疡病菌的样品反应管显现绿色，表明本发明所述的试剂盒及检测方法对番茄溃疡病菌具有很好的特异性。
[0025]应当说明的是，上述实施例为本发明的具体实施例子，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.番茄溃疡病菌中criC基因的LAMP检测引物组，包括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2和环引物，其核苷酸序列分别如下所示:外引物 I:TATGCCGCCGGTGACG (SEQ ID NO:I)；外引物 2:CCATCCGTGTGCCTGCA (SEQ ID NO:2)；内引物 1:ATCGACGGCGTTGGTCCGG-GGTGGAATCCGCTCTTCAC (SEQ ID NO:3);内引物 2:ATCCACGTAGCCGAACGCATCG-GCCCGAACTGGTCAGACC (SEQ ID NO:4); 环引物:TGCTCCACCCGCATCGA (SEQ ID NO:5)。2.番茄溃疡病菌中cytC基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分: (1)检测引物溶液:由权利要求1所述的5条引物配制的检测引物溶液，外引物1、外引物2、内引物1、内引物2、和环引物的浓度依次为4~6 MmoI/L,4-6 Mmol/L,32-48 Mmol/L、32—48 Mmol/L、4~6 Mmol/L ； (2)具有链置换活性的DNA聚合酶:浓度为7?9U/ μ L ; (3)1X 反应缓冲液:200 mmol/L Tris-HCl、pH 8.8，100 mmol/L KCl, 100 mmol/L(NH4)2SO4,40-100 mmol/L MgSO4,6-14 mol/L 甜菜碱； (4)dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成； (5)显色齐IJ:1000XSYBR GREEN I 荧光染料。3.根据权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述的检测引物溶液中含有5 Mmol/L 外引物 1、5 Mmol/L 外引物 2、40 Mmol/L 内引物 1、40 Mmol/L 内引物 2、5 Mmol/L环引物。4.根据权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8 U/μ L05.根据权利要求2所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于:所述的10X反应缓冲液中MgSOzp甜菜碱的浓度分别为80 mmol/L、8 mol/L06.利用权利要求2~5任一项所述的试剂盒检测番茄溃疡病菌的方法，包括以下步骤: (1)提取待测样品的基因组DNA； (2)配制待测样品的LAMP检测反应体系:在200μ L反应管内加入模板DNA 2~5 μ L、检测引物溶液I μ L、Bst DNA聚合酶I μ L、10 X反应缓冲液2.5 μ UdNTPs溶液2~5 μ L，用灭菌去离子水或超纯水补齐至总体积为25 μ L ; (3)运行LAMP扩增反应:63~65°C孵育30~60min，80°C孵育5min终止反应； (4)LAMP扩增结果的鉴定:在反应管中加入1~2μ L显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。
【专利摘要】本发明公开了番茄溃疡病菌中<i>cyt</i>C基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。引物组由5条特异性引物组成，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO：1~5所示。检测试剂盒包括检测引物溶液、具有链置换活性的DNA聚合酶、10×反应缓冲液、dNTPs溶液、显色剂。检测方法是采用特异性引物及具有链置换活性的DNA聚合酶，在63~65℃对样品DNA模板进行扩增，通过观察显色剂颜色变化，判断样品是否含有番茄溃疡病菌。本发明不需要特殊仪器，具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，适合现场检测。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/68, C12R1/01, C12Q1/04
【公开号】CN105219871
【申请号】CN201510739840
【发明人】毛芙蓉, 王利波, 刘燕妮, 王学国, 许世霖, 郑士金, 郑建超
【申请人】吉林省蔬菜花卉科学研究院
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年11月4日