免疫细胞DC-CIK治疗荷瘤小数的生存期
[0033]实施方式:
[0034]以下实施例仅为帮助本领域技术人员更好地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0035]《实施例1》人参提取物FQR1的制备
[0036]取生晒参500g，高速组织捣碎机粉碎，加入10倍量10mM pH7.4的Tris-HCl(0.15MNaCl)缓冲液充分搅拌后，4°C搅拌浸提12h。6000rpm离心30min，收集上清液。向沉淀中再次加入10倍量的10mM pH7.4的Tris-HCl (0.15MNaCl)进行二次浸提，离心后收集上清液，合并两次的上清液。向上清液中加入固体硫酸铵至终浓度为80%，搅拌均匀后4°C静置过夜离心，沉淀用蒸馏水洗涤3次后冻干。将冻干样品放入透析袋中，4°C透析过夜后冻干。冻干品即为人参提取物FQR1。
[0037]《实施例2》免疫细胞FQR1-DC-CIK的分离、诱导、培养
[0038]患者准备:根据免疫细胞FQR1-DC-CIK治疗的适应症和禁忌症，选择适合该治疗的肿瘤患者，告知该治疗所涉及的各种相关信息和注意事项，获得患者及家属的理解和配合；
[0039]签署知情同意书；检测血常规；
[0040]外周血动员:采血前24小时皮下注射GM-CSF150ug ；
[0041]外周血采集:病人采血前应清淡饮食，无菌抽取肿瘤患者外周血50ml，肝素钠抗凝并充分混匀，避免凝血；
[0042]肿瘤抗原获取:室温2000rpm离心沉淀10分钟，收集适量的上层血浆，灭活后加入诱导培养基(Gibico)诱导DC-CIK和CIK细胞培养；
[0043]单个核细胞分离:细胞沉淀物用生理盐水稀释混匀至原体积，轻轻加至淋巴细胞分离液表面，2500rpm条件下离心20分钟；
[0044]收集单个核细胞:离心结束，用一次性塑料巴氏小心收集淋巴细胞分离液表层细胞，移至50ml —次性塑料离心管中，加入生理盐水至50ml，混勾；
[0045]单个核细胞的洗涤:室温1500rpm离心沉淀10分钟。弃上清，沉淀物用生理盐水再次悬浮混匀，室温1300rpm离心沉淀7分钟；
[0046]FQR1-DC-CIK细胞的诱导、培养:离心结束，弃上清，沉淀物用含浓度为10ug/ml的人参提取物FQR1的DC-CIK诱导培养基悬浮，并用白细胞稀释液适当稀释计数。均分至4个75cm2的一次性塑料细胞培养瓶中，补充诱导培养基至50ml/瓶。置37°C、5% C02、饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养。其间根据细胞的生长状况适时换液扩增，直至细胞数量达到后续实验所需。
[0047]《实施例3》FQR-1诱导DC-CIK细胞的增殖
[0048]1、常规分离外周血单个核细胞，用RPM1-1640 (上海恪敏生物科技有限公司)调细胞浓度为IX 105/ml，分别接种于96孔细胞培养板，每孔100 μ 1，每板8孔，共三板；
[0049]2、分别用2Χ浓缩的FQR1-DC-CIK细胞和2Χ浓缩的常规诱导的DC-CIK培养液150 μ 1/孔，每板的前四孔标识为实验组、后四孔标识为对照组；
[0050]3、置37°C、5% C02(V/V)饱和湿度的二氧化碳培养箱中培养；
[0051]4、分别于不同时间段3天、5天、7天，检测其0D570 ;结果如图1所示。说明FQR1能有效提高DC-CIK细胞的增殖。
[0052]《实施例4》FQR1诱导活化DC-CIK细胞的杀肿瘤细胞活性
[0053]RPM1-1640培养基(上海恪敏生物科技有限公司)调整细胞浓度为1 X 105/ml，分别接种于96孔细胞培养板，每孔100 μ 1，每板8孔，共三板；
[0054]每孔分别加入150ul2 X浓缩的FQR1-DC-CIK细胞或2 X浓缩的常规诱导的DC-CIK细胞，同时，按照1:10分别加入NK细胞敏感细胞株-K562细胞株(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)。每板的前四孔标识为FQR-DC-CIK细胞组、后四孔标识为常规诱导的DC-CIK细胞组；
[0055]置37°C、5% C02(V/V)培养箱中共同培养；
[0056]培养后用MTT法检测其杀瘤活性；结果如图2所示。表明通过FQR1诱导培养的DC-CIK细胞，杀瘤活性高于常规培养的DC-CIK细胞。
[0057]《实施例4》荷瘤小鼠FQR1-DC-CIK细胞治疗前后生存期检测
[0058]1、复苏小鼠黑色素瘤B16细胞株(上海通派生物技术有限公司)；
[0059]2、取C57小鼠(上海义森生物科技有限公司)脾脏，常规制备小鼠FQR1-DC-CIK细胞和DC-CIK细胞；
[0060]3、C57小鼠腋下接种小鼠黑色素瘤B16细胞，每只注射约2.5X 106个，共三十只，随机分为三组；
[0061]4、从第三天起每日腹腔注射诱导7天的FQR1-DC-CIK细胞和DC-CIK细胞，共五次，每次每只注射IX 106个/0.5ml，空白对照组注射生理盐水0.5ml ；
[0062]5、观察并记录荷瘤小鼠的生存期。结果见图3，表明FQR1-DC-CIK细胞可以延长荷瘤小鼠的生存期。
【主权项】
1.一种人参提取物FQR1，其特征是，取生晒参，高速组织捣碎机粉碎，分别两次加入10倍量1mM pH7.4的Tris-HCl (0.15MNaCl)缓冲液，充分搅拌，浸提12h，离心后收集上清液，合并两次的上清液，并向其中加入固体硫酸铵至终浓度为80%，搅拌均匀后4°C静置过夜离心，沉淀用蒸馏水洗涤3次后冻干，4°C透析过夜后冻干，即可收获人参提取物FQRl。2.一种利用人参提取物FQRl诱导DC-CIK的方法，其特征是，所述方法依次包括以下步骤: 外周血采集:无菌抽取肿瘤患者外周血，肝素钠抗凝并充分混匀，避免出现凝血； 肿瘤抗原的获取:室温离心沉淀外周血，收集上层血浆，灭活备用； 单个细胞分离、收集:生理盐水稀释混匀所得细胞沉淀物，轻轻加至淋巴细胞分离液面，在650g条件下离心；离心结束后，加入生理盐水，混匀；室温离心沉淀，弃上清，生理盐水再次悬浮混匀，室温离心沉淀； FQR1-DC-CIK细胞诱导培养:沉淀物用含人参提取物FQRl诱导培养基悬浮，并用白细胞稀释液稀释计数，置饱和湿度的二氧化碳培养箱中进行培养，期间根据细胞的生长状况适时换液扩增，直至细胞数量达到实验所需。3.权利要求2所述的诱导方法，其特征是，FQR1-DC-CIK细胞诱导培养液中，所用人参提取物FQRl的浓度为0.0 lug/ml?lmg/ml。4.权利要求1所述人参提取物FQRl在制备肿瘤细胞免疫治疗药物中的应用。
【专利摘要】本发明提供了一种人参提取物FQR1及其制备和用途，并提供了FQR1诱导培养DC-CIK细胞的方法，其包括外周血采集、肿瘤抗原获取、单个核细胞分离、洗涤、DC-CIK细胞的诱导、培养等步骤；本发明获得的人参提取物FQR1，可以有效提高DC-CIK细胞的增殖、提高DC-CIK细胞杀瘤活性、延长DC-CIK细胞治疗荷瘤小鼠的带瘤生存期。
【IPC分类】C12N5/0784, C12N5/0783, A61K36/258, A61P35/00
【公开号】CN105238755
【申请号】CN201510708335
【发明人】杨兆勇, 李霞, 张志斐, 汪康游, 白利平, 张紫浓, 李亚东, 金媛媛
【申请人】东营凤起生物科技发展有限公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年10月27日