一种生长激素促分泌激素受体相关蛋白、核酸、制备方法及其应用
【专利说明】一种生长激素促分泌激素受体相关蛋白、核酸、制备方法及 其应用
[0001] 本申请要求基于2013年3月14日提出的美国临时专利申请N0. 61/748, 267优先 权的U.S.C. § 119权益的PCT国际申请案，其全部内容在此并入本文作为参考。
技术领域
[0002] 本发明涉及一种化合物及其应用，以用于遏制体重的过度增加、预防和治疗肥胖 症及其相关疾病。
【背景技术】
[0003] 过度肥胖是促成许多慢性疾病包括II型糖尿病、心血管疾病和癌症的危险因子 (Wang&MecPherson2011)。研究结果表明，适度地减轻体重对减轻心血管危险因子都有积 极的作用（Blackburn1995，Pi-Suneyer1996)同时还减少了II型糖尿病及糖尿病并发症 的危险（Bosello，Armellinietal1997)。
[0004] 干预生活方式是目前推荐的一线控制体重的方法，其目的是通过行为方式的改变 减少卡路里的摄入和增加体力活动。但仅用这些方法与药物干预保持体重减轻相比（6-12 个月）并不成功（GreyCooperetal. 2012)。很不幸，已经批准上市的大多数治疗肥胖病 的这类药物由于其副作用而不再使用（GreyCooperetal2012)。最近，用于治疗肥胖病 的肠激素获得了业界的关注（Neary&Batterham，2009)。的确，通过注射胰高血糖素类似 肽-l(GLP-l)和YY肽（PYY)以作用于人类大脑进食中枢能够降低食欲（DeSilva，Salem etal，2011)。另一个有前景的候选药物是来自胃的多肽激素胃饥饿素。体内循环的胃饥饿 素在体内的峰值是发生在体内能量衰竭状态下，它能激活食欲、促进神经肽Y(NPY)和位于 下丘脑弓状核的刺鼠基因相关多肽（AgRP)神经（Nakazato,Murakamietal. 2001)。这一 行为是通过胃饥饿素结合生长激素促分泌激素受体（GHS-Rla)而实现的（Kamegai，TamUra etal. 2000)。除了影响食欲，胃饥饿素还能促进脂肪细胞的分化和在脂肪组织优先储存卡 路里（Tschop，Smileyetal· 2000,Rodriguez,Gomez-Ambrosietal· 2009)。
[0005] 胃饥饿素多肽源自胃饥饿素前体，它是多肽前体通过降解产生乙酰化的胃饥饿 素（AG) (Zhu，Caoetal· 2006)、非乙酰化的胃饥饿素（UAG)和肥胖抑制素（Zhang，Ren etal· 2005)。然而，体外实验研究表明，UAG(Kojima，Hosodaetal· 1999)和肥胖抑制素 (Zhang,Renetal· 2005)不能与GHS-Rla结合。GHS-Rla是G蛋白偶联的受体（Howard， Feighneretal· 1996)，通过与其唯一的内源性配体AG结合而激活（Kojima,Hosodaet al. 1999)。最近的一项研究表明AG与GHS-Rla受体的结合，发生于受体位于细胞外的第二 个环状结构（EC2)，形成的一个疏水性的口袋。胃饥饿素在与受体的结合过程中，其乙酰化 疏水侧链能保持稳定（Pedretti,Villaetal· 2006)。
【发明内容】
[0006] 本发明披露了一种体内表达的GHS-Rla融合构建体，它是含有N端和细胞外结合 结构域的环状结构1和环状结构2的融合蛋白（GHSR/Fc)，令人感兴趣的是它能引起AG的 减少，但不影响UAG的水平，能使饮食高脂肪食物的小鼠避免体重增加，使小鼠的脂肪基 因表达发生改变，葡萄糖清除率和胰岛素敏感性得到改善。观察到的这些现象表明：这种 GHSR/Fc融合蛋白可能在治疗肥胖病及其相关疾病方面有临床应用价值。
[0007] -方面，本发明提供了一种可溶性的融合分子，其至少包括（a)生长激素促分泌 素受体（GHS-Rla)的以下部分之一：i)N-端区域，ii)胞外环状结构1，iii)胞外环状结构 2,与（b)连接到融合部分。
[0008] 具体讲，可溶性的融合分子至少包含GHS-Rla的：i)N_端区域，ii)胞外环状结 构1和iii)胞外环状结构2中的两个，连接到融合部分。换言之，可溶性的融合分子包含 GHS-Rla的i)N-端区域，ii)胞外环状结构1和iii)胞外环状结构2连接到融合部分。更 具体地讲，可溶性的融合分子是由GHS-Rla的i)N-端区域，ii)胞外环状结构1和iii)胞 外环状结构2,连接到融合分子组成。
[0009] 在一实施例中，GHS-Rla的N端的氨基酸序列如SEQIDN0 :4或13所示，或是其变 异体。胞外环状结构1的氨基酸序列如SEQIDN0 :6或15所示，或是其变异体。胞外环状 结构2的氨基酸序列如SEQIDN0 :8或17所示，或是其变异体。
[0010] 在一实施例中，GHS-Rla的N端结构域由SEQIDN0 :4或13所示的核苷酸序列转 录，或是由其变异体转录。胞外环状结构1的结构域由核苷酸序列SEQIDN0 :6或15转 录，或是由其变异体转录。胞外环状结构2由核苷酸序列SEQIDN0 :7或16转录，或是由 其变异体转录。
[0011] 在一实施例中，融合分子是一段稳定性分子。该分子或为稳定性蛋白质分子或为 聚合物。在一实施例中，稳定性蛋白质分子为免疫球蛋白的稳定结构域（Fc)或为白蛋白分 子。在一实施例中，，Fc结构域是IgG的Fc结构域，优选IgG2或IgG4。在另一实施例中， 稳定性聚合物为聚乙二醇。
[0012] 本发明的可溶性融合分子可以直接或是通过一段连接肽连接不止一段的细胞外 GHS-Rla的结构域，并且/或者GHS-Rla细胞外的结构域与融合结构的连接。
[0013] 在一实施例中，可溶性融合分子具有如SEQIDN0 :2或11所示氨基酸序列，或是 其变异体。由核苷酸序列SEQIDN0 :1或10转录，或为其变异体转录。
[0014] 本发明同样提供了核苷酸分子编码的可溶性融合分子。其中a)和b)为蛋白质， 由随意选取的连接肽连接。
[0015] 在另一实施例中，本发明提供了通过分离提取得到的一段核苷酸序列，该序列编 码GHS-Rla蛋白的N端结构域。在一实施例中，该提取的核苷酸包括核苷酸序列如序列SEQ IDN0 :3或12所示，由其编码的氨基酸序列如SEQIDN0 :4或13所示。在另一实施例中， 本发明提供了通过分离提取得到的一段核苷酸序列，该序列编码GHS-Rla蛋白的环状结构 1的结构域。在一实施例中，该提取的核苷酸包括核苷酸序列如SEQIDN0 :5或14所示， 或由其变异体组成，由其编码的氨基酸序列如SEQIDN0 :6或15所示，或由其变异体组成。 进一步提供了通过分离提取得到的一段核苷酸序列，该序列编码GHS-Rla蛋白的环状结构 2的结构域。在一实施例中，该核苷酸序列如SEQIDN0 :7或16所示，或由其变异体组成， 由其编码的氨基酸序列如SEQIDN0 :8或17所示，或由其变异体组成。
[0016] 本发明提供了一种宿主细胞含有披露的核苷酸分子
[0017] 本发明进一步提供了一种药学上的组成，该组成为本发明披露的可溶性融合分 子，该组成亦为本发明提供的核酸分子，该组成为本发明提供的宿主细胞，或是GHS-Rla的 细胞外结构域，或是一种载体，一种药学上可接受的载体。在一实施例中，GHS-Rla的细胞 外结构域可以是N端序列，也可以是环状结构1，环状结构2或是上述结构的集合。在另一 实施例中，GHS-Rla的细胞外结构域是环状结构1和/或环状结构2。
[0018] 另一方面，本发明提供了一种减轻过度肥胖的方法。即对有需要的动物中给以本 发明提供的可溶性融合分子，给以本发明提供的核酸序列，给以本发明提供的宿主细胞，给 以本发明提供的药学组成，或是给以GHS-Rla的胞外结构域以减轻过度肥胖。同样，提供如 何应用本发明披露的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本 发明提供的药学组成，或是应用GHS-Rla的细胞外结构域以减轻动物的过度肥胖。进一步， 应用本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发 明提供的药学组成，或是应用GHS-Rla的细胞外结构域制造减少动物过度肥胖的药物。更 进一步，用本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细 胞，本发明提供的药学组成，或是应用GHS-Rla的细胞外结构域在有需要的动物中应用以 减少动物的过度肥胖。在一实施例中，GHS-Rla的细胞外结构域是选自N端，环状结构1和 /或环状结构2,或是选自上述结构的集合。在另一实施例中，GHS-Rla的胞外结构域是指 环状结构2。
[0019] 在一实施例中，本发明对有需要的动物提供了一种可以减少体重增加的方法。该 方法包含给予本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主 细胞，本发明提供的药学组成，或是GHS-Rla的细胞外结构域。具体说，本发明对有需要的 动物应用了本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细 胞，本发明提供的药学组成，或是应用了GHS-Rla的胞外结构域。同样，提供如何应用本发 明披露的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的 药学组成，或是应用GHS-Rla的细胞外结构域以减轻动物的过度肥胖。进一步，应用本发明 提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药 学组成，或是应用GHS-Rla的细胞外结构域制造减少动物过度肥胖的药物。更进一步，本发 明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的 药学组成，或是GHS-Rla的细胞外结构域可以面向需要减少体重的动物制造药物。在一实 施例中，GHS-Rla的胞外结构域是选自N端，环状结构1和/或环状结构2,或是选自上述结 构的集合。在另一实施例中，GHS-Rla的细胞外结构域是指环状结构2。
[0020] 在另一实施例中，本发明提供了 一种在动物中治疗肥胖病和肥胖病相关疾病的方 法。该方法是用本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主 细胞，本发明提供的药学组成，或是用GHS-Rla的细胞外结构域。同样，提供应用本发明提 供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学 组成，或是用GHS-Rla的胞外结构域制造药物。进一步提供的就是本发明提供的可溶性融 合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是用 GHS-Rla的细胞外结构域。更进一步提供的是本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的 核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是提供GHS-Rla的细胞外结 构域对需要的动物治疗肥胖病及肥胖病相关的疾病。在一实施例中，GHS-Rla的细胞外结 构域是选自N端，环状结构1和/或环状结构2,或是选自上述结构的集合。在另一实施例 中，GHS-Rla的细胞外结构域是指环状结构2。
[0021] 在一实施例中，肥胖病相关疾病是指II型糖尿病，心血管疾病和癌症。在各种形 式的癌症中与肥胖病相关的部位包括食道、乳腺、子宫内膜、结肠直肠和胰腺。因此，在一实 施例中，与肥胖相关的癌症是指食道癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌以及胰腺癌。在另 一实施例中，与肥胖有关的状况是指以高胆固醇、高甘油三酯和高血压为代表的代谢综合 症（高血糖、高血压、高胆固醇和高甘油三酯）或多发性卵巢囊肿（PC0S)。
[0022] 在进一步实施例中，本发明提供了一种改善动物的血糖平衡和/或提高胰岛素敏 感性的方法。该方法对有需要的动物给以本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核 酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是给以GHS-Rla的细胞外结构 域。对有需要的动物还提供本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明 提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是GHS-Rla的胞外结构域的应用。具体说，应 用本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明 提供的药学组成，或是GHS-Rla的胞外结构域制造药物用以治疗需要改善血糖平衡和/或 提高胰岛素敏感性的动物。进一步提供的是本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的 核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是GHS-Rla胞外结构域制造 药物用以治疗需要改善血糖平衡和/或提高胰岛素敏感性的动物。更进一步提供的是本发 明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的 药学组成，或是GHS-Rla胞外结构域制造药物用以治疗需要改善血糖平衡和/或提高胰岛 素敏感性的动物。在一实施例中，GHS-Rla的细胞外结构域是选自N端，环状结构1和/或 环状结构2,或是选自上述结构的集合。在另一实施例中，GHS-Rla的细胞外结构域是指环 状结构2。
[0023] 本发明所指的动物可以是任何动物，如人类。在一实施例中，动物患有II型糖尿 病。
[0024] 本发明的其它特性和优点通过如下的详细说明是显而易见的。其很容易理解，但 是揭露本实施例的详细描述和具体例子都只能通过图解的方式给出。本发明从详细描述中 揭露的精髓和范围通过各种变化和修饰将明显成为一种技术。
【附图说明】
[0025] 本发明将以图例的形式进行说明：
[0026] 图1显示了 GHSR相关结构的有效性。图示全长（WT)和胞外结构域（GHSR/Fc)构 件。（A)结构域由N端（Nt)、胞外结构1和2(Ecl，Ec2)和鼠免疫球蛋白IgGl恒定区（Fc) 组成。使用抗Myc标签的抗体对细胞裂解液（L)和L6细胞（L)培养基进行免疫印迹反应。 用GHSR/Fc表达质粒转染CH0细胞。在L6肌肉细胞转染WT和GHSR/Fc表达质粒（D图中 转染细胞呈现灰色），用鼠抗IgG-Fc抗体进行免疫荧光反应。
[0027] 图2显示GHSR/Fc对体重增加量和其它代谢参数的影响。小鼠肌肉注射3次所示 表达质粒。第一次基因注射后次日起喂以高脂肪饮食（HFD)，整个进食过程监控体重的变化 (A)〇
[0028] 图3显示用抗Myc标签的抗体对实验结束前腓肠肌组织裂解液（A)和血浆（B)进 行免疫印迹反应的实验结果。研究结束前检测了总AG和UAG，乙酰化AG(C)和IGF-1⑶在 血液循环中的水平。数据经统计学处理Mean 土 SEM，*P〈0. 05。
[0029] 图4显示GHSR/Fc对脂肪组织的影响。实验结束后，观察了GHSR/Fc处理组和对 照组小鼠的腹腔脂肪垫（A)。对脂肪垫质量（B)和腓肠肌组织质量（C)进行定量分析显示 GHSR/Fc处理组和对照组小鼠的储存值（B)。用实时定量PCR和标准曲线法（D)对瘦素、 激素敏感性脂肪酶（HSL)、PPARy、白介素-1 (IL-1)和肿瘤坏死因子（TNFa)对ISSrRNA的 mRNA相对转录水平进行定量分析。数据经统计学处理Mean 土SEM，*P〈0. 05，**p〈. 001，（η =5)〇
[0030] 图5显示对腹膜内葡萄糖和胰岛素耐受性实验的结果。在HFD进食前和代谢笼实 验前进行葡萄糖耐受实验（IPTGG) (A)。葡萄糖耐受实验比较了GHSR/Fc处理组和对照组小 鼠的曲线下面积（AUC) (B)。在实验鼠处死前进行了胰岛素耐受实验（ITT) (C)。AUC结果显 示为D。数据经统计学处理Mean土SE，*Ρ〈0· 05, *#ρ〈· 0001，（η= 5)。
【具体实施方式】
[0031 ] 本项发明的GHS-Rla融合蛋白分子是一种诱饵蛋白，含有胃饥饿素受体配体结合 结构域。肌肉注射GHSR/Fc质粒减少了体内循环中的乙酰化胃饥饿素水平。当施以高脂肪 饮食（HFD)，诱饵蛋白处理组小鼠较对照组体重增加量降低，并伴有腹膜脂肪累积的减少但 并无肌肉质量的降低。定量RT-PCR结果显示处理组小鼠脂肪组织中PPARy和