实施例中，如果碱基突变点处不是核酸内切酶的酶切位点，则可 W通过在该突变点处引入核酸内切酶的酶切位点，进行改造后，然后再混合样本中加入引 入酶切位点的该核酸内切酶，然后加入相应可扩增目的基因型核酸片段的引物和DNA聚合 酶进行PCR反应，最后得到目的基因型片段。
[0031] 本发明的关键是在含有不同等位基因片段，如含有突变与野生片段的混合标本中 对其中特定基因型片段进行选择性破坏并使其变换为目的基因型基因片段。运一效应通过 W下Ξ个反应中的两种或Ξ种来达到目的：选择性破坏一种特定基因型基因片段，将破坏 后的断裂片段进行依赖于另种基因型模板的修复，和w另种模板的延伸反应实现基因型的 变换。
[0032] 特定基因型的核酸片段被破坏后，产生的断裂片段的Ξ末端有两种情形：一种是 Ξ末端具有与目的片段不配对的碱基，另一种是Ξ末端不具有与目的基因型核酸片段不配 对的碱基。后一种情形，断裂片段上与目的基因型核酸不配对的碱基位于断裂片段的五末 玉山 乂而。
[0033] 对于上述破坏反应后出现的第一种情形，基因型变换采用高保真聚合酶。此时，运 种体外基因型的变换本身所发生的化学变换位于断裂片段所致位置，在特定基因型片段被 破坏变成断裂片段后，具有Ξ末端核酸外切酶的高保真DNA聚合酶W完整未被破坏的目的 基因片段为模板，对断裂片段的Ξ末端进行校正修复，然后在有dNTP等聚合反应条件下对 其进行延伸反应，实现基因型的变换。
[0034] 而对于上述破坏反应后出现的第二种情形，基因型变换采用低保真聚合酶。此时， 基因型转换运一效应通过W下Ξ个反应中的两种反应来达到目的：选择性破坏一种特定基 因型基因片段，和W另种模板的延伸反应实现基因型的变换。
[0035] 上述基因型的变换本身不需要不同等位基因片段之外的引物参与。反应后达到基 因型变换的目的，基因型变换后的混合标本中的基因片段的总量不会增加，变换的是不同 基因型的片段数量，或者说，本发明本身是在将一种基因型基因片段变换为另一种基因型 基因片段。
[0036] 当使用针对基因型不同的位置之外侧翼序列设计的引物，则可达到在基因型变换 的同时，增加标本中基因片段的绝对数量。在运里，外侧引物的作用是增加基因片段的数 量，而基因型的变换，则与有无使用引物没有关系。
[0037] 本发明中，提供含有不同等位基因型的混合标本，可W采用本发明的实施例1或 实施例4的方法来制备得到，可W根据具体的不同等位基因的情况进行制备，或者直接采 用化学合成法合成，且运些制备方法为本领域常规的技术手段，是本领域技术人员公知和 惯用的技术手段。当然，不同等位基因型的混合标本还可W通过医院临床提供的可疑病人 样本或者各种医疗机构、研究机构提供的样本而获得。
[003引本方法破坏的基因型可W是一种或多种，变换的目的基因型同样可W是一种或多 种。但通常情况下，破坏的基因型为一种。运一点，对于肿瘤的早期检测，具有敏感和高效 的价值。肿瘤是由突变所导致，利用基因体外变换技术，在诊断肿瘤相关突变时，只需要破 坏野生序列运样一种特定的基因型，而对于待测标本中可能存在的不同基因突变型，则均 可成为目的基因型，从而达到针对肿瘤热点突变的不同突变类型设计方便和高效的检测技 术体系。基因型变换技术，还可用于一些耐药突变的早期诊断，W及用于检测自然环境中生 物物种的基因变异。本发明采用的是通过重复使用选择性破坏特定基因型核酸序列并将已 断裂的核酸片段通过W另种不被破坏的基因型片段为模板进行延伸，转化为目的所需要的 基因型片段。
【附图说明】
[0039] 下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述：
[0040] 图1为野生型APC质粒测序图谱。
[0041] 图2为含有APC热点突变的突变型APC质粒测序图谱。
[0042] 图3为内切酶PstI消化野生型APC质粒的PCR产物后的电泳图。其中，从左到右， 第1泳道为lOObp标准参照，第2泳道为PCR产物，第3泳道为PCR产物PstI消化产物上 样量为加1。电泳图显示第3泳道野生型片段完全被消化。
[0043] 图4为基因型转换后的基因片段用内切酶PstI消化检测的电泳图。其中，从左到 右，第1泳道为纯野生对照，第2泳道为野生与突变为3比1比例，第3泳道为野生与突变 为10比1比例，上样量为加1。电泳图显示1泳道野生型可W被完全消化，第2、3泳道加入 Oligo后片段全部转变成突变型，无法被限制性内切酶PstI消化。 W44] 图5为在引物存在下的对APC野生基因型进行转换，PCR后加PstI消化的电泳图。 其中，从左到右，第1泳道为纯野生对照，第2泳道为加01igoA+，第3泳道为加OligoA-，第 4泳道为同时加01igoA+和OligoA-。本实验结果显示长度较短的突变序列片段的存在能 导致野生片段的基因型转换。
[0045] 图6为TP53的电泳图，其中，第1泳道为l(K)bpDNA标准参照，第2泳道为纯野生 型对照，第3-6泳道依次为W/T30:1、300:1、3000:1、30000:1。本实验结果显示，基因破坏与 基因延伸偶联，在有突变片段存在时，能导致野生型基因片段转化为耐限制性酶消化的突 变型基因片段。而仅有野生型片段时，基因破坏与基因延伸偶联则不能导致野生型基因片 段向突变型基因片段的转化。
[0046] 图7为实施例3的测序图谱。
[0047] 图8为TP53野生型基因片段质粒测序图谱。
[0048] 图9为TP53突变型基因片段质粒测序图谱。
[0049] 图10为内切酶化eIII消化野生型TP53质粒的PCR产物后的电泳图；其中，从左 到右，第1泳道为lOObp标准参照，第2泳道为PCR产物，第3泳道为PCR产物化eIII消 化产物上样量为加1。
[0050] 图11为在引物存在下的对TP53野生基因型进行转换，PCR后加化eIII消化的 电泳图。其中，从左到右，第1泳道为纯野生对照，第2泳道为加OligoTP53+，第3泳道为 加OligoTP53-，第4泳道为同时加OligoTP53+和OligoTP53-。第5-8泳道依次为W/ T30:1、300:1、3000:U30000:1，第9泳道为50bp标准参照。实验结果显示，短的突变型寡 核巧酸，和等长的突变型PCR产物，均能使野生序列转变为突变片段。野生片段能被核酸酶 消化，而突变片段不能被核酸酶裂解。本实验中当野生片段与突变片段比例为30:1时，野 生片段基本转换成为突变片段；当该比例为300:1时，部分野生片段转化为突变片段。
[0051] 图12为实施例5中PCR完成后使用化elll酶对PCR产物进行酶切验证。
[0052] 图13为实施例5中使用Taq酶进行PCR扩增，得到大量突变型基因序列后使用 化elll酶酶切验证图谱。
[0053] 图14为野生型序列PCR产物用化elll酶消化后电泳图。
[0054] 图15为PCR反应完成后再用限制性内切酶化elll进行消化电泳图。 阳05引图16为W/T= 10:1基因转换实验测序图。
[0056] 图17为W/T= 100:1基因转换实验测序图。
[0057] 图18为W/T= 1000:1基因转换实验测序图。
【具体实施方式】
[0058] W下结合具体实施例对上述方案做进一步说明。应理解，运些实施例是用于说明 本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中采用的实施条件可W根据具体应用条件做进 一步调整，未注明的实施条件通常为常规实验中的条件。
[0059] 此次实施例中所用的引物和Oilgo均为化学合成。PMD-19T质粒购自美国promega 公司，耐高溫核酸内切酶PST1，化ellI酶购自美国化rmentas，化q酶，高保真DM聚合酶购 自美国Ferment曰S。 W60] -、对APC基因4012OT基因型的转换实验：APC基因突变与多种肿瘤的发生和药 物敏感性密切相关。本实施例针对APC基因4012OT突变开展基因型的转换实验。
[006U实施例1利用短的突变序列对APC野生序列进行基因型转换。
[0062] (一）：野生与突变模板的制备
[0063] APC4012OT基因突变附近的序列如下（cDNA上4012处CTG￡AG-CTGJAG): W64]APC野生型基因片段序列，如SeqNo. 1所示，长度19化P;APC突变型基因片段序 列，如SeqNo. 2所示。
[0065] 为制备相关模板，使用下列四条引物：
[0066] P1+:GCTAAGCTTAGATCCTGTGAGCGAAG，如SeqNo. 3 所示；
[0067] P1-:GCTGGATCCAGATTTCGCTCCTGAACA，如SeqNo. 4 所示；
[0068] P2+:AACCCTACAGTCTGCTGGATTTGGTTC，如SeqNo. 5 所示；
[0069] P2-:CCAGCAGACTGTAGGGTTCTAGTTTATC，如SeqNo. 6 所示。
[0070] 1.野生型模板构建操作步骤： 阳07UW基因组DM为模板，P1+和P1-为引物，PCR，切胶纯化产物，用Hindlll和Ba恤I 酶切PCR产物，胶纯化；同时用Hindlll和BamH