、枯草芽孢杆菌及天蓝色链霉菌的基因组DNA作为模板。
[0065][2]根据恶臭假单胞菌的葡萄糖脱氢酶基因序列、枯草芽孢杆菌的L-丙氨酸脱氢酶基因序列、天蓝色链霉菌的缬氨酸脱氢酶基因序列以及pET-duet质粒上的酶切位点设计基因引物。
[0066]PPpglcdhF:5，-CGGGATCCATGAGCACTGAAGGTGCGAACC-3’ (BamH I)
[0067]PPpglcdhR:5，-CCCAAGCTTTTACTCGGCTAATTTGTAAG-3’ (Hind III)
[0068]PBsadhF:5，-GGGGTACCATGATCATAGGGGTTCCT-3，(Kpn I)
[0069]PBsadhR:5，-CCGCTCGAGTTAAGCACCCGCCACAGATG-3’ (Xho I)
[0070]PScvdhF:5’-GGAATTCCATATGGTGACCGACGTAAACGG-3’ (Nde I)
[0071]PScvdhR:5，-CGAGCTCTCACGGCCGGGGACGGGCCT-3，(Xho I)
[0072][3]利用恶臭假单胞菌、枯草芽孢杆菌及天蓝色链霉菌DNA作为模板做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系:模板2 μ L，上下游引物各0.5 μ L，dNTP Mix 4yL,1XEx TaqBuffer 5yL，灭菌 ddH20 37 μ L, ExTaq DNA 聚合酶 I μ L。PCR 反应条件:94°C 预变性，5min，一个循环；94°C变性，lmin, 56°C 退火，lmin, 72°C延伸，lmin 30s，30 个循环；72°C，1min,一个循环；15°C，10min，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，_20°C冰箱保存备用。
[0073][4]构建重组质粒 pMD18-T-Ppglcdh/pMD18-T-Bsadh/pMD18-T-Scvdh，导入感受态E.coliJM109o PCR胶回收产物连接克隆载体pMD18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5yL，基因4.8yL, pMD18_IU 2 μ L，16°C过夜连接。连接产物转化E.coilJM109，转化方法参照实施例[5]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37°C培养过夜，挑取菌落到1mL液体LB培养基中，37 °C摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T_Ppglcdh/pMD18-T-Bsadh/pMD18-T-Scvdh,经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于_70°C冰箱保藏。
[0074][5]将[4]中提取的质粒pMD18-T_Ppglcdh和表达载体pET-duet分别用BamHI和Hind III进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-duet-Ppglcdh转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[5]，用氨苄霉素抗性平板筛选阳性克隆。37°C摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40°C冰箱保藏备用。
[0075][6]将[4]中提取的质粒pMD18-T_Bsadh和表达载体pET-duet-Ppglcdh分别用Kpn I和Xho I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将[4]中提取的质粒pMD18-T-Scvdh和表达载体pET-duet-Ppglcdh分别用Nde I和Xho I进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-duet-Ppglcdh+Bsadh/pET-duet-Ppglcdh+Scvdh转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[5]，用氨苄霉素抗性平板筛选阳性克隆。37°C摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40°C冰箱保藏备用。
[0076]实施例4:重组质粒pET-28a-Ecltd/pET-28a_Seltd的构建及转化
[0077][I]以大肠杆菌、鼠伤寒沙门(氏)菌的基因组DNA作为模板。
[0078][2]根据大肠杆菌、鼠伤寒沙门(氏)菌的L-苏氨酸脱氨酶基因序列以及pET_28a质粒上的酶切位点设计ltd基因引物。
[0079]PEcltdF:5，-ACCGGGATCCATGGCTGACTCGCAACCCCT-3，(BamH I)
[0080]PEcltdR:5，-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAAAAAGAACCTG-3，(Hind III)
[0081]PSeltdF:5，-ACCGGGATCCATGGCGGAATCTCAACCTCT-3，(BamH I)
[0082]PSeltdR:5，-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAGAAAGAACC-3，(Hind III)
[0083][3]利用大肠杆菌及鼠伤寒沙门(氏)菌DNA作为模板做PCR扩增得到基因。PCR扩增体系:模板 2 μ L，上下游引物各 0.5 μ L，dNTP Mix 4 μ L, 1XExTaq Buffer 5yL，灭菌ddH20 37 μ L, ExTaq DNA聚合酶I yL。PCR反应条件:94°C预变性，5min，一个循环；94°C变性，lmin，56°C退火，lmin，72°C延伸，lmin 30s，30 个循环;72°C，lOmin，一个循环;15°C，lOmin，一个循环。采用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。回收产物存放在1.5mL的离心管中，_20°C冰箱保存备用。
[0084][4]构建重组质粒 pMD18-T-Ecltd/pMD18-T_Seltd，导入感受态 E.coli JM109。PCR胶回收产物连接克隆载体pMD 18-T，其中连接体系中连接缓冲液加酶5 μ L，基因4.8 μ L，pMD18-T 0.2 μ L，16°C过夜连接。连接产物转化E.coilJM109，转化方法参照实施例[5]，转化产物涂布含氨苄青霉素的LB平板，经37°C培养过夜，挑取菌落到1mL液体LB培养基中，37°C摇床过夜培养后提取质粒，命名为pMD18-T-Ecltd/pMD18-T-Seltd，经酶切验证连接成功后，将菌液加入甘油于_70°C冰箱保藏。
[0085][5]将[4]中提取的质粒和表达载体pET-28a分别用BamH I和Hind III进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收后进行连接。将连接好的重组质粒pET-28a-Ecltd/pET-28a-Seltd转化到感受态E.coli BL21，转化方法参照实施例[5]，用卡那霉素抗性平板筛选阳性克隆。37°C摇床过夜培养后提取质粒，酶切验证正确后保藏菌种，-40°C冰箱保减备用。
[0086]实施例5:大肠杆菌感受态的制备及质粒的转化
[0087][I]大肠杆菌感受态的制备。将单克隆大肠杆菌于1ml LB培养基中活化，之后转接于37°C振荡培养至0D_0.35即可制备感受态；将培养好的菌液置于冰水中，轻轻摇晃使菌液迅速冷却约1min ;准备灭好菌的1.5ml离心管若干个，分装菌液于管中，每管装菌量1.2ml，将离心管放置于冰中；菌液离心8000r/min 10_20s，冰水中静置2min，弃上清，加入预冷好的0.1M CaCl2400 μ L，轻轻吹吸悬浮液，放入冰中15min (该步骤重复2_3次)；最后，每管菌液离心弃上清后加入预冷好的0.1M CaCl280 μ L，轻轻吹吸悬浮菌液放入冰中。
[0088][2]质粒的转化。取[I]制备好的感受态细胞，加入需要转化的质粒，轻轻反复吹吸，并在冰中放置45min ;将离心管放入42°C水浴锅准确放置90s，然后取出迅速放入冰中5min ;加入LB培养基800 μ L，轻轻混合，37°C摇床培养1_1.5h ;菌体离心2min，弃大部分上清，再重新吹吸悬浮，取200 μ L于目标抗性平板，置于37°C培养箱中培养；待转化子长出之后提质粒验证。
[0089]实施例6:串联来源于枯草芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶及来源于蜡样芽孢杆菌的L-亮氨酸脱氢酶重组菌全细胞转化联产α -氨基丁酸和葡萄糖酸
[0090][I]将重组菌pET-28a-Ecltd/BL21和串联有L-亮氨酸脱氢酶的pET-28a-Bsglcdh+Bcldh/BL21利用LB培养基活化，37 °C、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8%，培养温度37°C，转速300r/min，通气量l.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28°C，诱导16h后，4°C，8000r/min离心1min收集菌体，用pH 7.0的50mM PB缓冲液分别将pET-28a_Ecltd/BL21和pET-28a_Bsglcdh+BcIdh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH 7.0的50mM PB缓冲液中，向该体系中投入IM L-苏氨酸和IM葡萄糖及0.1% (v/v)tween-80,于30°C、300r/min进行转化，转化过程中补充碳酸I丐以保持反应液pH为6.0。分不同时