间取样，离心并用0.22 μ m滤膜过滤后经HPLC分析。α -氨基丁酸的产率为102.Sg/L，葡萄糖酸的产率为196.8g/L。
[0091][2]氨基酸的HPLC分析条件:在EP管中依次加入转化液样品200 μ L，衍生剂400 μ L (取1mg邻苯二甲醛+0.5ml无水乙醇，再加入2ml pH 9.5的0.1 M硼砂缓冲液及50 μ L 2-巯基乙醇)，混匀后等待2分钟加入400 μ L 0.1M KH2PO4缓冲液，严格控制时间和试剂添加量，然后进样。色谱柱:dimosoil C18(5 μ I, 250mmX4.6mm)，流动相:0.05M醋酸钠缓冲液:甲醇-63:35，检测器:UV Detector，检测波长:338nm，柱温:40°C，进样量:20yL,流速:1.0ml/mino
[0092][3]葡萄糖酸的HPLC分析条件:色谱柱:Aminex HPX-87 (300mmX 7.8mm)，流动相:5mM H2SO4，检测器:UV Detector，检测波长:210nm，柱温:30°C，进样量:10yL，流速:0.6ml/min。
[0093]实施例7:串联枯草芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶及红球菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶重组菌全细胞转化联产α-氨基丁酸和葡萄糖酸
[0094]将重组菌pET-28a_Ecltd/BL21和串联有L-苯丙氨酸脱氢酶的pET-28a-Bsglcdh+Rjpdh/BL21利用LB培养基活化，37 °C、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8%，培养温度37°C，转速300r/min，通气量l.0vvm。培养2-3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28°C，诱导16h后，4°C，8000r/min离心1min收集菌体，用pH 7.0的50mM PB缓冲液分别将pET-28a_Ecltd/BL21和pET-28a-Bsglcdh+Rjpdh/BL21两种重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH7.0的50mM PB缓冲液中，向该体系中投入IM L-苏氨酸和IM葡萄糖及1% (v/v)甲苯，于30°C、300r/min进行转化，以IM NaOH溶液以保持反应液pH为7.0。分不同时间取样，离心并用0.22 μ m滤膜过滤后经HPLC分析(同实施例6中的HPLC方法)。测得α -氨基丁酸的产率为87.3g/L，葡萄糖酸的产率为164.2g/L。
[0095]实施例8:串联恶臭假单胞菌来源的葡萄糖脱氢酶及枯草芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶重组菌全细胞转化联产α-氨基丁酸和葡萄糖酸
[0096]将重组菌pET-28a_Seltd/BL21和串联有L-丙氨酸脱氢酶的pET-duet-Ppglcdh+Bsadh/BL21利用LB培基活化，37°C、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8 %，培养温度37°C，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2_3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28°C，诱导16h后，4°C，8000r/min离心1min收集菌体，用pH 7.0的 50mM PB 缓冲液分别将 pET-28a-Ecltd/BL21 和 pET-28a_Bsglcdh+Rjpdh/BL21 两种重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的PH 7.0的50mM PB缓冲液中，向该体系中投Λ IM L-苏氨酸和IM葡萄糖及0.2% (v/v)曲拉通X100，于30°C、300r/min进行转化，以5M氨水以保持反应液pH为8.0。分不同时间取样，离心并用0.22 μ m滤膜过滤后经HPLC分析(同实施例6中的HPLC方法)。测得α -氨基丁酸的产率为67.6g/L，葡萄糖酸的产率为 135.2g/L。
[0097]实施例9:串联恶臭假单胞菌来源的葡萄糖脱氢酶及天蓝色链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶重组菌全细胞转化联产α-氨基丁酸和葡萄糖酸
[0098]将重组菌pET-28a_Seltd/BL21和串联有L-缬氨酸脱氢酶的pET-duet-Ppglcdh+Scvdh/BL21利用LB基活化，37°C、160r/min培养过夜后分别转接于2L的LB基中。接种量8%，培养温度37°C，转速300r/min，通气量1.0vvm。培养2_3h后加入终浓度为0.5mM的IPTG，诱导温度降低为28°C，诱导16h后，4°C，8000r/min离心1min收集菌体，用pH 7.0的50mM PB 缓冲液分别将 pET-28a-Ecltd/BL21 和 pET-28a_Bsglcdh+Rjpdh/BL21 两种重组大肠杆菌洗涤二次，重悬于培养时同等体积的pH 7.0的50mM PB缓冲液中，向该体系中投入IM L-苏氨酸和IM葡萄糖及0.5% &八)0^8，于30°(:、30(^/1^11进行转化，以51氨水以保持反应液pH为7.0。分不同时间取样，离心并用0.22 μ m滤膜过滤后经HPLC分析(同实施例6中的HPLC方法)。测得α -氨基丁酸的产率为74.9g/L，葡萄糖酸的产率为142.2g/L。
【主权项】
1.一种串联葡萄糖脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶重组大肠杆菌用于联产α -氨基丁酸和葡萄糖酸的方法，其特征包括以下内容: 1)将葡萄糖脱氢酶基因与L-氨基酸脱氢酶基因构建重组共表达载体pET-28a_Bsglcdh+Bcldh、 pET-28a_Bsglcdh+Rjpdh 及 pET-duet-Ppglcdh+Bsadh、pET-duet-Ppglcdh+Scvdh,并将其转化E.coli BL21，成功构建了基因工程菌pET-28a_Bsglcdh+Bcldh/BL21、pET-28a_Bsglcdh+Rjpdh/BL21、pET-duet-Ppglcdh+Bsadh/BL21, pET-duet-Ppglcdh+Scvdh/BL210同时将L_苏氨酸脱氨酶(ltd)基因利用分子技术进行克隆，构建重组表达载体pET-28a-Ecltd和pET-28a-Seltd，并将其转化E.coli BL21，成功构建了基因工程菌 pET-28a-Ecltd/BL21 及 pET-28a_Ecltd/BL21。 2)使用重组大肠杆菌在LB培养基进行诱导培养，然后进行全细胞转化。利用pH7.0的50mM PB缓冲液洗涤细胞然后将细胞重新悬浮于pH6.0-8.0的50mM PB缓冲液中，在不加入任何辅因子的情况下，加入1M L-苏氨酸、1M葡萄糖及0.1-1%的增加细胞通透性的表面活性剂，利用添加一定的化学试剂调节使转化的pH保持在6.0-8.0之间，并控制转化的温度在30-42°C之间，制备得到α -氨基丁酸和葡萄糖酸。2.根据权利要求1所述的一种串联葡萄糖脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶重组大肠杆菌用于联产α-氨基丁酸和葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述的葡萄糖脱氢酶选自:但不限于，芽孢杆菌来源的葡萄糖脱氢酶、假单胞菌来源的葡萄糖脱氢酶。3.根据权利要求1所述的一种串联葡萄糖脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶重组大肠杆菌用于联产α-氨基丁酸和葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述的L-氨基酸脱氢酶选自:但不限于，芽孢杆菌来源的L-亮氨酸脱氢酶、芽孢杆菌来源的L-丙氨酸脱氢酶、链霉菌来源的L-缬氨酸脱氢酶、红球菌来源的L-苯丙氨酸脱氢酶。4.根据权利要求1所述的一种串联葡萄糖脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶重组大肠杆菌用于联产α-氨基丁酸和葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述的L-苏氨酸脱氨酶选自:但不限于，大肠杆菌来源的L-苏氨酸脱氨酶、鼠伤寒沙门(氏)菌来源的L-苏氨酸脱氨酶。5.根据权利要求1所述的一种串联葡萄糖脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶重组大肠杆菌用于联产α -氨基丁酸和葡萄糖酸的方法，其特征在于，所述的增加细胞通透性的表面活性剂为:但不限于，吐温80、甲苯、曲拉通Χ100、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)。6.根据权利要求1所述的一种串联葡萄糖脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶重组大肠杆菌用于联产α -氨基丁酸和葡萄糖酸的方法，其特征在于不向转化反应液中添加任何辅因子。
【专利摘要】本发明是一种串联葡萄糖脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶重组大肠杆菌用于联产α-氨基丁酸和葡萄糖酸的方法。将葡萄糖脱氢酶基因与L-氨基酸脱氢酶基因构建重组共表达载体并将其转化至基因工程菌大肠杆菌内。同时构建好表达L-苏氨酸脱氨酶的重组大肠杆菌。高效共表达葡萄糖脱氢酶及L-氨基酸脱氢酶于大肠杆菌中可以促进辅因子在菌体胞内的循环，不需要添加任何外源辅因子，利用该辅因子循环再生系统可以利用廉价底物L-苏氨酸及葡萄糖联产高附加值的α-氨基丁酸和葡萄糖酸，该转化过程简单快捷，成本低廉。在5L发酵罐中该方法所得的α-氨基丁酸和葡萄糖酸产量分别可达102.8g/L及196.8g/L，为其工业化生产提供了一种实际有效策略。
【IPC分类】C12P13/00, C12P7/58, C12N15/70
【公开号】CN105255934
【申请号】CN201510814936
【发明人】饶志明, 周俊平, 杨套伟, 张蔡喆, 戚云龙, 郑俊贤, 张显, 徐美娟
【申请人】江南大学
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年11月23日