Gelextractionkit,Qiagen，美国）进行纯化。
[0143] 为获得scFvDNA，使用50ng的各自经纯化的Vh和VlDM作为模板，其与30pmole 正向引物和30pmole反向引物（表3)、10XPCR缓冲液、200μΜdNTPW及0.5μΙTaqDM 聚合酶混合至终体积50μL。对混合物进行PCR反应，94°C，5分钟；随后如下进行20个循 环：94°C，30秒；56°C，30秒和72°C，2分钟。将PCR扩增的抗体DNA在1 %琼脂糖凝胶上进 行电泳W根据大小分离每种扩增的DNA，然后使用凝胶提取试剂盒（Qiagen，美国）进行纯 化。 。144] (2-2)通过限制忡酶切割杭体DNA
[0145] 通过限制性酶Sfil(Roche,美国）切割上述制备的scFv和隧菌粒载体 pCombSX(theScrippsResearchInstitute，CA，美国）。
[0146]将lOyg编码scFv的PCR片段，360 单位的SfiURoche，美国）W及 20yg的lOX 缓冲液混合至终体积200μ以并在50°C反应过夜。
[0147] 此外，将20μg的pComb3X载体，120单位的Sfil和20μL的10X缓冲液混合至 终体积200μ以并在50°C反应过夜。对通过限制性酶切割获得的片段进行电泳，然后使用 凝胶提取试剂盒（Qiagen，美国）进行纯化。 。"引 (2-3)杭体DNA的连接巧专库的制备
[0149] 为了将scFv片段插入到pComb3X载体中，将在（2-2)中使用Sfil切割的7(K)ng编 码scFv的PCR片段，与1. 4μg的pComb3X混合。添加T4DNA连接酶（Invitrogen，美国） 后，将混合物在16°C反应过夜。通过乙醇沉淀来纯化连接混合物。然后，通过电穿孔用混合 物转化大肠杆菌邸2738 (New化glandBiol油，美国），并在46μg/mL簇节青霉素和70μg/ mL卡那霉素的存在下进行培养，W制备复杂性为1. 5X1〇9的文库。
[0150] 实施例3.选择含有抗VEGFscFv的隧菌体克隆
[0151] 从实施例2中获得的含有scFv形式之随机化重链和轻链的文库中，使用固体固定 的VEGF选择与人VEGF和小鼠VEGF二者都结合的抗体。 。15引 (3-1)洗择与VEGF结合的杭体
[015引首先，将lOug人VEGF(R&Dsystems,美国）和小鼠VEGF(R&Dsystems,美国）各 自缀合到磁珠。
[0154] 将实施例2中获得的抗体文库DNA(其被构建W使得scFv形式的抗体W与隧 菌体外壳蛋白ΡΙΠ融合的形式展示）通过电穿孔转染到大肠杆菌邸2738(New化gland Biol油）中，然后将其在37°C培养。添加VCSM13辅助嗜菌体（Stratagene，美国）之后，进 一步添加46ug/ml簇节青霉素和70ug/ml卡那霉素，随后在SB培养基（30g/L膜蛋白腺， 20g/L酵母提取物和lOg/LMOPS,抑7.0)中培养过夜。
[0155] 将上述获得的含有大肠杆菌和隧菌体的培养基离屯、W移除大肠杆菌沉淀。回收上 清液之后，添加40mg/ml的聚乙二醇8000和30mg/ml的化C1，随后离屯、W收集阳G沉淀的 隧菌体，其在PBS中重悬。
[0156] 与磁珠缀合的人VEGF或小鼠VEGF与隧菌体在室溫下反应两小时W允许对VEGF 有亲和力的隧菌体结合，然后将所得的样品用含有0. 5%Tween20的PBS洗涂，用0. 1M甘 氨酸（pH2. 2)洗脱，并用2Mtris溶液中和。为了下一轮的淘选（panning),用洗脱的隧菌 体感染大肠杆菌ER2738并培养过夜。通过重复该过程4次来进行淘选。
[0157] 随着淘选的循环逐渐增加，洗涂的次数增加，导致具有高结合亲和力的隧菌体累 积。为了发现人VEGF和小鼠VEGF二者的结合物，使用仅人VEGF或交替的人VEGF和小鼠 VEGF作为抗原。
[0158] 在lOOug/ml簇节青霉素、70ug/ml卡那霉素W及VCSM13辅助嗜菌体（1 : 1000) 存在下，将从每个第四轮淘选输出选择的单个克隆在96深孔板中在37°C培养过夜，从而诱 导表达抗体的隧菌体增殖。
[0159]因此离屯、所获得的培养液W获取含有隧菌体的培养物上清液。将所获取的培养物 上清液添加到用VEGF包被的化ISA板并在37°C解育2小时。使用HRP缀合的抗M13抗体 作为二抗通过化ISA鉴定与VEGF结合的抗体。 。160] (3-2)所洗杭体的测序
[0161] 将在实施例3-1中选择的含有对人VEGF和小鼠VEGF二者显示出阳性信号之克 隆的邸2738在SB培养基中培养过夜，并离屯、W获得大肠杆菌。使用DNA微型制备试剂盒 (GeneAll，韩国）来获得质粒DNA并分析其碱基序列。使用在表4中示出的测序引物（SEQ IDNO138和139)来确定碱基序列。所选择的克隆被称为"克隆F"。在表1中示出了克隆 F抗体的详细碱基序列信息。
[0162][表"
[0163]
[0164] 实施例4.人源化和亲和力改进
[0165] 将从动物免疫抗体文库获得的抗体克隆F的框架转变成人抗体框架，同时不改变 对抗原结合重要的一些残基（Nishibori等，MolecularImmunology, 43 (2006))。
[0166] 为了亲和力改进，对重链和轻链的CDR序列进行随机化W产生新的隧菌体文库。 通过在实施例2中所示的相同方法，将所获得的隧菌体文库与10μg固定到磁珠的lOug人 VEGF在室溫反应2小时并用含0. 5 %Tween20的PBS洗涂5次。洗涂之后，用0. 1M甘氨 酸（pH2.2)溶液洗脱与抗原结合的隧菌体并用2Mtris溶液中和。在第二轮淘选中，将样 品用含有Tween20的PBS洗涂10次，并且在第Ξ轮淘选中用含有Tween20的PBS洗涂20 次W提高选择压力。
[0167] 经过W上过程的克隆F的变体克隆被称为"HF2-1至HF2-26"，并且通过化ISA和 BIAcore来验证其结合亲和力。结果，确认从W上过程获得的与人VEGF和小鼠VEGF结合 的抗体具有比母代克隆F高至少10倍的亲和力，其中一些克隆显出出高至少100倍的亲和 力。
[0168] 实施例5.抗体的生产
[0169] 为了上述获得之抗体的亲和力测量和活性分析，产生scFv或免疫球蛋白（IgG)蛋 白。
[0170] 为了scFv蛋白产生，用含有所选克隆之DNA的pComb3X质粒转化大肠杆菌 皿2151，随后纯化所表达的scFv。
[0171] 具体地，当0.化值达到1时添加ImM异丙基β-D-1-硫代化喃半乳糖巧（IPTG)， 随后在37°C培养过夜。然后通过离屯、分离大肠杆菌和培养基。为了纯化结合C末端化S 标签的scFv，将scFv蛋白质与儀NTA柱（GE，美国）结合，用250-300mM咪挫溶液洗脱并在 PBS缓冲液中透析过夜。
[0172] 为了IgG产生，通过使用实施例2中的条件和表5中所示的引物组合进行PCR来 从含有scFv的pComb3x获得重链和轻链的可变区W及恒定区的片段。 阳17引通过使用表5中的HC和LC引物组合进行PCR获得重链和轻链的可变区化及恒定区拍和 Q)，并使用P姊餅ATM3J-TOPCrtTA克隆试剂盒和pOp谢rMVEC-TOP〇@TA 克隆试剂盒（Invitrogen，美国）转移到哺乳动物细胞表达质粒。将ΙμΙ的每种载体 (pc防VATM3.3-TOP0it载体和pOptiTMVEC-TOP〇K载体）W及片段添加至含 有200mM之化C1和lOmM之MgClz的缓冲液，至总体积为6μL，并在室溫下反应5分钟。通 过施加热激来转化DH5a大肠杆菌感受态细胞并且将运样获得的集落在大规模上培养W 获得质粒。
[0174] 用上述制备的质粒转染肥K293F细胞（Invitrogen，美国），并使用蛋白A柱（GE， 美国）纯化培养7天后所获得的抗体。将培养基上样至柱W允许培养基中的抗体（IgG)结 合蛋白A。然后用20mM巧樣酸钢缓冲液（pH3.0)洗脱抗体。轻链和重链的分子量与理论 上计算的值一致，并且通过SDS-PAGE确认了高度的纯度。
[0175][表引
[0176]
[0177]实施例6.结合亲和力的测量
[017引分别用0. 2μg/ml的人VEGF和小鼠VEGF(R&Dsystems,美国）包被ELISA板，并W系列稀释浓度解育由皿2151表达之scFv形式的实施例5中获得的纯化蛋白质或者由 293F细胞表达的IgG。结果，在实施例3-2中获得的克隆FW及通过亲和力改进获得的其 变体显示出与人VEGF和小鼠VEGFW浓度依赖性方式的良好结合。
[017引期间，按照制造商的说明书，将人VEGF和小鼠VEGF与簇甲基化葡聚糖生物传感器 忍片（CM5，G巧偶联W测量亲和力。为了测量结合和解离速率，将IgG蛋白系列稀释2倍至 5nM、2. 5nM、l. 25nM、0. 625nM、0. 313nM和 0. 156nM并进行注射。
[0180] 通过结合与解离传感图表示结合与解离速率并使用简单地1 :ILangmuir结合 模型度lAcoreX100评估软件，2.0版）计算。按照解离速率常数化d)除W结合速率常数 化a)计算的平衡解离常数（KD)在指示高亲和力的亚纳摩尔水平得到确认。在表6中示出 了抗体HF2-1至HF2-1UHF2-13和HF2-14针对人VEGF化VEG巧的测量值，并且在图1中示 出作为一个代表性实例的HF2-11的传感图。
[0181][表 6]
[0182]
[0183] 实施例7.抑制配体-受体结合的验证
[0184] 为了验证本发明所选的抗体（HF2-1、HF2-5、HF2-9和HF2-11)对VEGF与VEGF受 体KDR(下文称为VEGF哟或VEGF受体Flt-1 (下文称为VEGFR1)之结合的抑制作用，如下 进行实验。
[018引 将 0.5μg/ml的人VEGF包被到 96 孔ELISA板并用含 3 %BSA和 0.05 %Tween20 的PBS溶液封闭。将6nM的Flt-1ECDIgG-Fc融合蛋白（27-687，R&Dsystems,美国）或 9nM的邸RECDIgG-Fc融合蛋白（R&Dsystems,美国）与系列稀释 0). 01nM、0.lnM、0. 3nM、 lnM、3nM、lOnM和lOOnM)的每种抗体HF2-l、HF2-5、HF2-9和HF2-11 -起添加至每个孔，并 在37°C解育1小时。尽管抗体抑制Flt-1ECDIgGFc融合蛋白和邸RECDIgG-Fc融合蛋 白结合，然而使用抗人IgG-Fc抗体HRP缀合物（JacksonImmunoresearch，美国），随后通 过ABTS显色和在405皿测量吸光度检测结合。
[018引结果，如图2所示，本发明的抗体W浓度依赖性方式抑制VEGF与KDR(VEGF哟的 结合，但不抑制VEGF与Flt-1 (VEGFR1)的结合。因此，确认本发明所选的抗体选择性地抑 制VEGF与VEGF受体的结合。
[0187] 实施例8.结合特异性的验证
[0188] 为测量本发明所选的抗体HF2-l、HF2-5、HF2-9和HF2-11对人VEGF-A化VEGF-A)、 小鼠VEGF-A(mVEGF-A)、人VEGF-B化VEGF-B)、人VEGF-C化VEGF-C)、人VEGF-D化VEGF-D)和 人胎盘生长因子（PIGF)的结合特异性，如下进行实验。
[0189]分别用 0. 2μg/ml各蛋白质化VEGF-A、mVEGF-A、hVEGF-B、hVEGF-C、hVEGF-D和 PIGF) (R&Dsystems)各自包被化ISA板的孔。在用含有3%BSA和0. 05%Tween20的PBS 在37°C封闭30分钟后，将提高浓度的抗体克隆蛋白在37°C解育2小时。然后用含有3% BSA和0. 05%Tween20的PBS洗涂孔3次，向其添加抗人IgG-F油-HRP缀合物（Jackson Immunoresearch，美国）并在室溫下解育1小时。然后将它们用含有3%BSA和0. 05%Tween 20的PBS洗涂3次，并使用TMB显色，在650皿下测量吸光度。使用阿瓦斯汀（Roche,瑞 ±)作为对照。
[0190] 如图3中所示，本发明的抗体克隆良好结合hVEGF-A和mVEGF-A，而根本不结合 VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或PIGF，表明对VEGF的高特异性。
[0191] 实施例9.物理化学特征的分析
[0192] 对本发明抗体的物理化学特征进行分析。
[0193] 在DTT存在W移除二硫键的还原条件下和在不存在DTT处理的非还原条件下，使 用NuPAGE4-12%Bis-T;ris凝胶（InvitrogenCo.)、SDS聚丙締酷胺凝胶电泳（SDS-PAGE) 分析确认整个抗体的轻链和重链的存在。在图4中示出作为一个示例性实例的HF2-11的 分子量测量结果。
[0194] 如图4所示，在非还原条件（NR，5μg)下分析的试样显示出在116kDa大小标记 和205kDa大小标记之间的主带，确认了对应于整个抗体之大小的条带的存在。在还原条件 巧，2μg)下分析试样显示出分别在55kDa和20.IkDa大小标记附近的主带，确认了对应于 抗体的重链和轻链之条带的存在。因此，通过SDS-PA(iE鉴定了对应于整个抗体、重链和轻 链的条带，并且未发现其他主要的杂质条带。
[0195] 另外，使用液相色谱/质谱法化C/M巧确认了HF2-4的分子量，及其与理论氨基酸 序列的估计值一致。在图5(a)和化）中示出了作为一个代表性实例的HF2-4之重链和轻 链的质量分析结果。
[0196] 在部分还原试样后，分析重链和轻链的质量。重链显示的主峰为50. 6kDa大小而 轻链