子致伤可W提高转化效率。可W通 过切割、研磨、穿孔、超声处理、等离子体造伤或真空渗透来帮助对植物材料致伤。相应地， 在转化之前对包含部分胚轴的第一子叶节段的额外致伤可W用作本公开的一个实施方案。
[0144] 包含部分胚轴的分割的大豆种子通常用含有合适基因构建体的±壤杆菌培养物 接种大约0. 5至3. 0小时，更典型地为大约0. 5小时，随后是在合适的培养基上进行长达大 约5天的共培养期。通过培养被转化的含有一部分胚轴的分割的大豆种子，产生出推定含 有转基因拷贝的外植体。对运些外植体进行鉴定和分离，用于进一步的组织繁殖。
[0145] 通过将外植体在合适的诱导培养基中培养大约两周时间，随后在含有合适选择剂 如草锭麟的培养基中再培养2周，可W促进芽诱导。优选地在没有选择剂的培养基和有选 择剂的培养基之间轮换。在其他可W成功采用的方案中，芽诱导培养基包含可选择剂，或者 芽诱导培养基和选择培养基被合并成包含可选择标志物的单一培养基。其它在培养基中总 是含有选择剂的方案也可W成功地采用。经过一段时间的芽诱导之后，可W切下含有一部 分胚轴的组织分离物，将其转移到合适的芽伸长培养基中。在具体的实施方案中，子叶可W 被移除，并通过切割子叶的基部切除含有胚轴的平齐的芽垫（shootpad)。见实施例2。 阳146] 通常，在转化后向切割种子的外植体施加一种或多种选择剂。选择剂杀死或阻滞 非转化大豆细胞的生长，并可有助于清除残余的±壤杆菌细胞。合适的试剂包括草锭麟或 双丙氨麟。其它合适的试剂包括，但不仅限于，除草剂草甘麟或除草剂2, 4-D，它们既可作 为选择剂又可作为芽诱导激素。此外，选择剂可W包括多种抗生素，包括壮观霉素、卡那霉 素、新霉素、己龙霉素、庆大霉素、和G418,运取决于所使用的可选择标志物。根据所使用的 试剂不同，选择1-7天可能是适当的。 阳147] 可使用合适的试剂激励已伸长的芽生根，运样的试剂包括但不限于各种浓度的生 长素和细胞分裂素。例如，就生长素一一吗I噪3-下酸（IBA)而言，可W在将植物材料转移 到本领域技术人员已知的合适生根培养基之前，将其加到细胞组织培养基中。在暴露于IBA 之后，根形成经历大约1-4周，更典型地1-2周。
[0148] 生长芽的培养可W用本领域公知的方法实现，W产生成熟的转基因大豆植物。见 例如实施例2。
[0149] 成功的转基因事件的存在可W用本领域已知的技术加W确认，所述技术包括但不 仅限于，在用±壤杆菌感染并共培养之后的任何阶段，对大豆中的整合的可选择标志物和/ 或报告基因构建体进行TAQMAN?、PCR分析、和Southern分析；对显示报告子构建体证据的 植物或植物种质进行表型测定；或在合适的选择培养基上选择外植体。
[0150] 在实施方案中，本文公开的方法用于帮助育种程序，W开发表达感兴趣基因的近 交大豆系和开发优良的大豆栽培种。包含稳定整合的转基因的近交大豆系可W和其它近交 大豆系杂交，W产生表达感兴趣基因的杂交植物。将期望性状基因渗入到优良大豆系和杂 交体中可w用本公开的方法和本领域已知的方法迅速地实现。 阳151] 现将本文所引证的所有参考文献，包括出版物、专利和专利公开援引并入本申请， W它们与本公开的明文细节不相冲突为限；且其并入本申请的程度，与将每篇文献被单独 且明确地申明通过援引并入本申请，且在本申请中全文给出相同。本文中讨论的参考文献 仅是为了其在本申请之前的公开而提供的。本文的任何内容均不应被理解为承认本发明人 没有资格基于发明在先而使运些公开内容被视为晚于本申请。 阳152] 提供了如下的实施例W举例说明本公开的某些特定的特征和/或方面。运些实施 例不应被理解为将本公开限制于本文所举例的运些特定的特征或方面。 实施例
[0153] 实施例1:载体构建
[0154] 使用本领域公认的方法构建了单个双元载体，标记为PDAB9381 (图7)。PDAB9381 含有两个植物转录单元（PTU)。第一个PTU(SEQIDN0:1)的组成为：拟南芥泛素-10启动 子（A优bilO启动子；Callis等.，1990)，其驱动黄色巧光蛋白编码序列（PhiYFP;Shagin 等.，2004)，该序列含有从马铃馨（Solanumtuberosum)分离的内含子、光特异性组织可 诱导LS-1基因（ST-LS1内含子；Genbank登录号No.X04753)，并W根癌±壤杆菌开放阅读 框-233'非翻译区（AU10RF233'UTR;Gelvin等.，1987)终止。第二个PTU(沈QIDN0:2) 被克隆在异戊締基转移酶编码序列（iptCDS;Genbank登录号NO.X00639. 1)内，其组成为： 木馨叶脉花叶病毒启动子（CsVMV启动子；Verdaguer等.，1996)，用于驱动麟丝菌素乙酷转 移酶编码序列（PAT;Wohlleben等.，1988)，并W根癌±壤杆菌开放阅读框-13'非翻译区 (A化0RF13'UTR出uang等.，1990)终止。所得的双元载体含有可视报告基因和抗生素可 选择标志物基因，并随后用于大豆的转化。 阳1W] 使用电穿孔将双元载体PDAB9381移动到根癌±壤杆菌菌株EHA101和EHA105〇tood等.，1986)中。鉴定在含有抗生素壮观霉素的YEP培养基上生长的克隆个体。 分离单个克隆，并通过限制酶消化确认PDAB9381双元载体的存在。 阳156]实施例2 :使用含有一部分胚轴的分割种子进行±壤杆菌介导的大豆转化 阳157] 种子准备开发了一种新的±壤杆菌介导的大豆转化方案。成熟的大豆（Glycine max)Maverick栽培种种子用氯气过夜灭菌16个小时。用氯气灭菌之后，将种子置于开放 容器中，放置在LAMINAR?层流罩内，W驱散氯气。接着，使用黑盒在24°C黑暗中用无菌Η2〇 使灭菌后的种子吸涨16小时。 阳15引分割的大豆种子的准备包含部分胚轴的分割的大豆种子的规程要求准备大豆种 子材料，使用切割工具（例如固定在手术刀上的#10刀片）纵向切割大豆种子材料。沿着 种子的种厮将切割工具插入大豆种子的种皮（图5)纵向切割大豆种子材料，W分离和除去 种皮，并将种子分割成两个子叶部分（图6)。仔细地部分除去胚轴，其中大约1/2 - 1/3的 胚轴保留附着于子叶的节端（nodalend)(图4)。该方法不同于前人描述的在将成熟的种 子分割成两个子叶部分时导致胚轴几乎完全去除的转化方法。
[0159] 接种然后将含有胚轴的部分的分割的大豆种子浸没在含有PDAB9381双元质粒 的根癌±壤杆菌菌株EHA101或EHA105的溶液中30分钟。在浸没包含胚轴的子叶之前， 将根癌±壤杆菌溶液稀释到终浓度为λ=0.60Dew。
[0160]共培养接种后，在用滤纸片覆盖的培养皿中让分割的大豆种子与根癌±壤杆 菌菌株在共培养培养基（Wang,Kan.AgrobacteriumProtocols. 2.1.化WJersey,Humana Press, 2006.Print.)上共培养 5 天。 阳161] 芽诱导共培养5天后，将分割的大豆种子在液体芽诱导（SI)培养基中清洗，该 培养基的组成为：B5盐、B5维生素、28mg/L亚铁（Ferrous)、38mg/L胞2邸TA、30g/L薦糖、 0. 6g/LMES、1.llmg/LBAP、100mg/LTIMENTIN?、200mg/L头抱嚷目亏和 50mg/L万古霉素（pH 5.7)。然后，在芽诱导I(SII)培养基上培养分割的大豆种子，该培养基的组成为：B5盐、 B5 维生素、7g/LNoble琼脂、28mg/L亚铁（Ferrous)、38mg/L胞2邸TA、30g/L薦糖、0.6g/L MES、1.llmg/LBAP、50mg/LTIMENTIN?、200mg/L头抱嚷目亏、50mg/L万古霉素（pH5. 7)，使 子叶的平侧（flatside)朝上，子叶的节端浸没在培养基中。培养2周后，将自经转化的分 割大豆种子产生的外植体转移到芽诱导II(SIII)培养基中，该培养基含有SII培养基并 补充6mg/L草锭麟(L旧ERTY彩)。；
[0162] 芽伸长在SIII培养基上培养2周后，从外植体除去子叶，并通过在子叶的基部 进行切割，切出含有子叶的平齐芽垫。将来自子叶的分离芽垫转移到芽伸长（S巧培养基 上。沈培养基的组成为：MS盐、28mg/L亚铁、38mg/LNa2EDTA、30g/L薦糖和0. 6g/LMES、 50mg/L天冬酷胺、lOOmg/Lk焦谷氨酸、0.Img/LIAA、0. 5mg/LGA3、lmg/L玉米素核糖巧、 50mg/LTIMENTIN?、200mg/L头抱嚷目亏、50mg/L万古霉素、6mg/L草锭麟、7g/LNoble琼脂 (pH5. 7)。每2周将培养物转移到新鲜SE培养基上。让培养物在24°C的C0NVIR0N?生长 室内，1化光照、光强为80-90μmol/m2sec的条件下生长。
[0163] 生根对于从子叶芽垫发出的伸长芽，通过在子叶芽垫基部切割伸长芽，并将伸长 芽浸入Img/LIBA(吗I噪3-下酸）中1-3分钟来促进生根。接着，将伸长芽转移到植物生 长托盘（Phytatray)内的生根培养基中（MS盐、B5维生素、28mg/L亚铁、38mg/L胞2邸TA、 20g/L薦糖和 0. 59g/LMES、50mg/L天冬酷胺、lOOmg/Lk焦谷氨酸、7g/LNoble琼脂，pH 5. 6)。 阳164] 培养在24°C、1化光周期的C0NVIR0N?生长室中培养1-2周后，将已发根的芽转 移到有盖的圣代杯（sundaecup)中的±壤预混物中，并放置在C0NVIR0N?生长室中（型号CMP4030 和CMP3244,ControlledlinvironmentsLimited,Winnipeg,Manitoba,Canada)的 长白昼条件下（16小时光照/8小时黑暗），光强为120-150ymol/m2sec，恒溫（22°C)恒湿 (40-50% )，W便使小植株适应环境。生了根的小植株在圣代杯中适应环境数周，之后转移 到溫室中进行进一步的环境适应并建立强壮的转基因大豆植物。
[0165] 实施例3:包含部分胚轴的分割大豆种子通过±壤杆菌介导转化的转基因事件的 确认
[0166] 使用实施例2所述的新的±壤杆菌介导转化包含部分胚轴的分割大豆种子的转 化方法，产生了含有包含YFP和PATPTU的T-链插入物的转基因大豆事件。 阳167] 使用该新型方法总共完成了 6个独立的转化实验，其中EHA101和EHA105菌株各3 个实验。对于在溫室中生长的T。推定大豆转基因事件，进一步分别通过PAT和YFPPTU的TAQMAN?和PCR分析加W确认。表1和表2提供了平均转化频率的结果。总体上，运种新的 ±壤杆菌介导转化包含部分胚轴的分割大豆种子的转化方法导致前所未有的13.3% (范 围：4. 6% -20. 5% )和20. 3% (范围：14. 0-26. 5% )的转化效率。运些转化效率结果大大 高于在本领域中描述的使用子叶节转化法狂eng等.（2004)，PlantCellR巧22:478-482) 和半种子转化法（Paz等.（2006)，PlantCellR巧25:206-213)的大豆转化方法所报告的 大豆转化效率。
[0168] 运种新的±壤杆菌介导转化包含部分胚轴的分割大豆种子的转化方法导致转化 频率增加到与Zeng等.（2004)的大豆子叶节转化方法的转化频率相比为~3. 7倍。先前文 献报告指出，Zeng等.（2004)的大豆子叶节转化方法实现的转化效率水平高达5.9%。然 而，运种新的±壤杆菌介导转化包含部分胚轴的分割大豆种子的转化方法结果仍然出人意 料地比先前文献中报道的大豆子叶节转化方法的转化效率更高效。
[0169] 类似地，新的±壤杆菌介导转化包含部分胚轴的分割大豆种子的转化方法导致的 转化频率是Paz等（2006)的半种子转化方法的转化频率的~14倍。先前文献报告指出， Paz等（2006)的半种子转化方法导致3. 8%的整体转化效率。然而，新的±壤杆菌介导转 化包含部分胚轴的分割大豆种子的转化方法结果仍然出人意料地比先前文献中报道的大 豆半种子转化方法的转化效率更高效。
[0170] 表1:从包含部分胚轴的分割的大豆种子产生的转基因事件的第一次实验。平均 转化频率是所有使用EHA101和EHA105 ±壤杆菌菌株完成的转化实验的结果 阳 171]
[0172]表2:从包含部分胚轴的分割的大豆种子产生的转基因事件的第二次实验。 阳 173]
[0174]实施例4 :通过±壤杆菌介导转化具有部分胚轴的分割大豆种子产生的转基因事 件的可遗传性化erit油ility)的确定
[01巧]将确认含有YPF和PAT转基因拷贝的T。大豆植物进行自体授精，对从总共247个 转基因事件获得的Τι种子进一步筛选可遗传性。将转基因Τ1大豆种子种植并培育在溫室 中。在发育的V1-V2期（在种植1-2个Ξ叶苗之后大约10-14天），用1.0%ν/ν草锭麟 (LIBERTY饭（410邑ae/haL巧ayerCropSciencesLLC)溶液喷洒植物。此夕F，对Τι大 豆植物使用TAQMAN?和PCR分析对PAT和YFP植物转录单元二者进行分子分析。根据草锭 麟除草剂耐受性、pat和y巧转基因的存在确定，Τι代有总共116个事件（47% )被确认是 转基因的（表3)。其余大豆事件没有将pat和y巧转基因从Τ。传递到Τ1代。运些Τ1大豆 植物未能继承转基因是由于产生了包含被转化到非胚系大豆组织内的pat和y巧转基因的 T。大豆事件。转基因整合到非胚系大豆组织中是一个常见的技术问题，在本领域已知的其 它大豆转化方法中也普遍有描述，不是上壤杆菌介导转化含有部分胚轴的分割大豆种子的 转化方法所独有的。 阳176]表3:用包含部分胚轴的分割大豆种子产生的转基因大豆事件的可遗传性阳 177]
[0178] 实施例5:使用含有部分胚轴的分割大豆种子进行±壤杆菌介导的大豆转化并使 用草甘麟作为选择剂
[0179] 将上述大豆转化方案（见实施例2)用于表达草甘麟耐受性状的转基因的转化和 选择。DGT-28基因（国际专利公开NO.W02013116700)被纳入基因表达盒作为可选择和除 草剂耐受性状，并用于转化包含部分胚轴的分割大豆种子外植体。
[0180] 最开始，完成剂量响应研究。为了测试草甘麟对外植体的影响，从发芽起始阶段 起，向所用的培养基添加草甘麟。测试的草甘麟范围是0.025-0. 2mM。在组织培养基中 加入运一浓度范围的草甘麟在大豆（Clemente等.，2000 ;Hinchee等.，1996 ;Ma;rtinell 等.，2006 ;Ma;rtinell等.，1999 ;Ma;rtinell等.，2002)、烟草（Singer等.，1985)、棉花 狂hao等.，2006)和小麦（化等.，2003)中已有报道。对未经转化的大豆外植体的培养测 试了 5个浓度的草甘麟。加入SI-2培养基中的浓度是0. 025mM，0. 05mM，0. 075mM，0.ImM和 0. 2mM。未转化的大豆外植体从SI-2培养基到组织培养方案完成的所有连续亚培养阶段中 保持相同比率的草甘麟选择。在每个亚培养阶段计数健康外植体的数目。丢弃死亡的外植 体，并将健康的外植体进一步亚培养到合适的培养基上。 阳181] 在含有各种浓度草甘麟的SI-2培养基上培养结束时（例如，大约2周时间），外植 体显示子叶黄化。黄化程度与施加到培养基中的草甘麟的剂量成正比。在含有草甘麟的培 养基上外植体的生长也被阻滞。接着，除去子叶，并将外植体从SI-2培养基亚培养到SE培 养基上。在SE培养基上进行另外2周的选择结束时，可W观察到当外植体暴露于不同水平 草甘麟时，外植体的生长有显著差异。外植体生长的阻滞与草甘麟剂量的增加成比例。类 似地，死亡外植体的数目也与草甘麟剂量的增加成比例。死亡外植体的数目随着草甘麟剂 量的增加而增加。在本研究使用的最高剂量下（例如0. 2mM)，在SE