-1结束时仅有一个外 植体存活。相比之下，在不含有草甘麟的对照培养基上几乎所有的外植体保持存活。尽管 有一些外植体到SE-1结束为止能够在草甘麟的所有测试水平下存活，但是全部外植体在 SE-2结束时，即选择6周之后，均已死亡（表4)。运些结果表明，即使在组织培养基中测试 的最低剂量的草甘麟下（例如0. 〇25mM)，也没有大豆外植体能够在6周的草甘麟选择后存 活。随后，在±壤杆菌介导的转化的含有部分胚轴的分割的大豆种子外植体的选择方案中 加入3个不同浓度的草甘麟（例如，0. 025mM，0. 05mM和0.ImM)。
[0182] 表4 :剂量响应研究结果。表中提供了在含有一定范围草甘麟的不同类型培养基 上经过了亚培养的每个阶段的外植体的数目 阳183]
[0184]使用本领域公知的程序构建了单个双元载体，标记为PDAB107553 (图8)。 PDAB107553含有两个植物转录单元（PTU)。第一个PTU(SEQIDN0:3)的组成为：拟南芥 泛素-10启动子（AtUbilO启动子；Callis等.，1990)，其驱动dgt-28编码序列值GT-28 ; aiagin国际专利公开No.W02013116700)，该序列含有叶绿体转运肤TraP23灯rap23 ; 国际专利公开No.W02013116764)，并W根癌±壤杆菌开放阅读框-233 '非翻译区 (AU10RF233'UTR;Gelvin等.，1987)终止。第二个PTU(沈QIDN0:4)的组成为：木馨 叶脉花叶病毒启动子（CsVMV启动子；Verdaguer等.，1996)，其用于驱动麟丝菌素乙酷转 移酶编码序列（PAT;Wohlleben等.，1988)，并W根癌±壤杆菌开放阅读框-13'非翻译区 (A化0RF13'UTR出uang等.，1990)终止。所得的双元载体含有除草剂耐性可选择标志物 /抗性基因和抗生素可选择标志物基因，随后用于大豆的转化。 阳化日]使用电穿孔将双元载体PDAB107553转移到根癌±壤杆菌菌株EHA105〇tood等.，1986)中。鉴定在含有抗生素壮观霉素的YEP培养基上生长的克隆个体。分离单个克 隆，并通过限制酶消化确认PDAB107553双元载体的存在。 阳186] 使用实施例2所述的新型±壤杆菌介导转化包含部分胚轴的分割大豆种子的转 化方法，用携带PDAB107553的±壤杆菌菌株转化了成熟的大豆（Glycinemax)Maverick栽 培种种子。在包含部分胚轴的分割的大豆种子转化方法的选择方案中加入了Ξ个不同浓度 的草甘麟（例如，0. 〇25mM, 0. 05mM和 0.ImM)。 阳187] 随着转化实验进行到各个亚培养阶段，大豆外植体的健康恶化。在最高水平的草 甘麟（例如0.ImM)下观察到最大的不良生理效应，不良生理效应随着草甘麟浓度降低而减 小。在第一轮选择（即在SI-2培养基上2周）之后，在草甘麟选择下培养的大豆外植体可 见子叶黄化。在越高比率的草甘麟下，大豆外植体的子叶黄化强度越突出（图9)。
[0188] 当大豆外植体被保持在含草甘麟的培养基上时，观察到外植体在与培养基直接接 触的植物组织表面上显示软化。外植体的表面变软，稠度变得类似稀奶油（creamy)。软化 效应从SE-1阶段起往后变得非常显著。相应地，将外植体转移到不含草甘麟选择剂的培养 基上。重复1和重复2的外植体中有一半在SE-1阶段结束时被转移到不含有任何草甘麟 选择剂的培养基上。随后，在SE-2结束时，将所有外植体转移到不含任何草甘麟选择剂的 培养基上（表5)。因为重复1和重复2中的软化非常明显，所W在SI-2阶段结束时，重复 3的外植体中有一半被转移到不含任何草甘麟选择剂的培养基上。到SE-1阶段结束时为 止，重复3外植体全部被转移到不含任何草甘麟选择剂的培养基上。
[0189] 表5 :显示了经过每个亚培养阶段的外植体的数目。提供了处于选择下的每个培 养阶段的外植体的数目，而下划线的数字显示了被转移到无选择的培养基上的外植体的数 目 阳 190]
[0191]
[0192] 对于所有Ξ个重复，当外植体被转移到不含草甘麟的培养基上时，外植体的软化 效应并没有结束，并且外植体软化在随后的全部亚培养阶段均持续。运些结果表明，一旦外 植体被暴露于草甘麟，该暴露便会触发组织软化，并且软化会持续，即使是随后将外植体转 移到无草甘麟的培养基上也是如此。
[0193] 从外植体分离所有存活的芽的样品，并送交分子分析W确认它们是否是转基因 的。在确认芽中存在或不存在转基因之后，将转基因大豆事件转移到生根培养基，并随后送 至溫室适应环境并在±壤中进一步培育。
[0194] 如表6所示，组织培养基中草甘麟的每种处理均导致转基因芽的产生。尽管对暴 露于草甘麟的外植体有软化效应，但是在草甘麟的全部测试浓度下均产生了转基因芽。而 且，将芽转移到生根培养基，许多芽成功地生了根。总体上，含有部分胚轴的分割大豆种子 的转化的转化效率为5. 3%-3. 9%。然而，转基因植物有一些损失，运些植物未产生根。此 夕F，当转基因植物未能在溫室中存活时，转化效率会降低。因此，对于能够在溫室中存活并 能够产生种子的生根转基因植物而言，转化频率为0. 63% (例如，产生8株转基因植物）。 从运些实验可知，使用包含部分胚轴的分割大豆种子并加入草甘麟作为选择剂的转化方法 产生了转基因大豆植物。
[0195] 表6:显示了在运些实验中基于早期分析（生根之前）和就成功生根的转基因芽 的数目而言评估的每个处理的转化频率 阳 196]
阳 197]
[0198] 实施例6:使用含有部分胚轴的分割大豆种子进行±壤杆菌介导的大豆转化并使 用潮霉素作为选择剂
[0199] 利用上述的大豆转化方案（见实施例2)转化并选择赋予潮霉素抗性的转基因。将 hpt基因（Gritz，L.和Davies,J. (1983)Gene25(2-3) ; 179-188)合并到基因表达盒中作 为可选择标志物，并用于转化包含部分胚轴的分割的大豆种子。 阳200] 首先完成剂量响应研究。为了测试潮霉素对外植体的影响，从发芽起始阶段 起，向所用的培养基添加潮霉素。潮霉素对大豆化ck栽培种和大豆Maverick栽培种植 物的测试范围是5mg/X-25mg/L。从两家不同供应商SigmaA1化ich(St.Louis,M0)和 ^^otech(化awneeMission,K巧获得了 5个浓度的潮霉素，并用于测试培养未经转化的 大豆外植体。加入SI-2培养基中的浓度是5mg/l，lOmg/L，15mg/l，20mg/L和25mg/L。未转 化的大豆外植体在从SI-2培养基到组织培养方案完成的所有连续亚培养阶段中保持在相 同比率的潮霉素选择下。在每个培养阶段计数健康外植体的数目。丢弃死亡的外植体，并 将健康的外植体进一步亚培养到合适的培养基上。 阳201] 在含有潮霉素的培养基上培养结束时，观察到当外植体暴露于不同水平的潮霉素 时，外植体的生长有显著差异（表7)。外植体生长阻滞与潮霉素的剂量增加成比例。类似 地，死亡外植体的数目也与潮霉素剂量的增加成比例。死亡外植体的数目随着潮霉素剂量 的增加而增加。在本研究中使用的最高剂量下（l〇mg/l-25mg/L)，只有少量外植体存活。类 似地，大量外植体能够在含有5mg/L潮霉素的培养基上存活。相比之下，在不含有潮霉素的 对照培养基上，几乎全部的外植体均保持存活。尽管在SE-1结束时大量外植体能够在潮霉 素的所有测试水平下存活，但是对于在含有浓度为l〇mg/l-25mg/L的潮霉素的培养基上培 养的外植体，在SE-2阶段结束时，大部分外植体死亡。运些结果表明，测试的5mg/L的潮霉 素剂量可被接受用于组织培养基。 阳202] 表7 :剂量响应研究结果。表中提供了在含有一定范围潮霉素的不同类型培养基 上经过了亚培养的每个阶段的外植体的数目阳203]
阳204] 使用本领域公知的程序构建了单个双元载体，标记为PDAB105958 (图10)。 PDAB105958含有两个植物转录单元（PTU)。第一个PTU(SEQIDN0:5)的组成为：木馨 叶脉花叶病毒启动子（CsVMV启动子；Verdaguer等.，1996)，其驱动hpt编码序列（HPT; Gritz和Davies，1983)，并W根癌±壤杆菌开放阅读框-233'非翻译区（AUl0RF233'UTR; Gelvin等.，1987)终止。第二个PTU(沈QIDN0:6)的组成为：拟南芥泛素10-启动 子（A优bilO启动子；Callis等.，1990)，其驱动麟丝菌素乙酷转移酶编码序列（PAT; Wohlleben等.，1988)，并W根癌±壤杆菌开放阅读框-13'非翻译区（Al:u0RF13'UTR; 化ang等.，1990)终止。所得的双元载体含有除草剂耐性可选择标志物/抗性基因和抗生 素可选择标志物基因，随后用于大豆的转化。 阳205] 使用电穿孔将双元载体PDAB105958转移到根癌±壤杆菌菌株EHA105〇tood 等.，1986)中。鉴定在含有抗生素壮观霉素的YEP培养基上生长的克隆个体。分离单个克 隆，并通过限制酶消化确认PDAB105958双元载体的存在。 阳206] 使用实施例2中所述的新的±壤杆菌介导转化包含部分胚轴的分割大豆种子的 转化方法，用携带PDAB105958的±壤杆菌菌株转化成熟的大豆（Glycinemax)Maverick栽 培种种子。在包含部分胚轴的分割大豆种子转化方法的选择方案中加入了Ξ个不同浓度的 潮霉素（例如，Smg/L,Smg/l,和 3mg/L)。 阳207] 在将大豆外植体保持在含有潮霉素的培养基上时，观察到外植体在与培养基直接 接触的植物组织表面上显示软化。相应地，在SE-3培养阶段，将外植体转移到不含潮霉素 选择剂的培养基上（表8)。
[020引表8 :显示了潮霉素的浓度和在每个选择阶段结束时存活的外植体数目阳209]
阳211] 从外植体分离所有存活的芽的样品，并送交分子分析W确认它们是否是转基因 的。在确认芽中存在或不存在转基因之后，将转基因大豆事件转移到生根培养基，并随后送 至溫室适应环境并在±壤中进一步培育。如表9所示，组织培养基中一半的潮霉素处理导 致了转基因芽的产生。尽管对暴露于潮霉素的外植体有软化效应，但是在含有潮霉素选择 剂的培养基上产生了转基因芽。从运些实验可知，使用包含部分胚轴的分割大豆种子并加 入潮霉素作为选择剂的转化方法产生了转基因大豆植物。
[0212] 表9 :显示了在运些实验中根据早期分析（生根之前）和成功产生转基因芽的数 目评估的每个处理的转化频率阳21引
[0214] 尽管已经对本发明进行了详细描述，但是应当理解，运些细节完全是用于举例说 明的目的，在不背离由W下权利要求限定的本发明精神和范围的前提下，本领域的技术人 员能够做出各种修改。
【主权项】
1. 一种产生转基因事件的方法，该方法包括： 将切割工具插入大豆种子的种皮以形成第一子叶节段和第二子叶节段，其中所述种子 包含胚轴； 用土壤杆菌接种包含部分所述胚轴的第一子叶节段，所述土壤杆菌包含至少一个转基 因；并 培养经接种的子叶节段以在经转化的植物细胞中产生转基因事件。2. 权利要求1的方法，其中该方法还包括在接种所述第一子叶节段之前从所述第一子 叶节段和第二子叶节段除去种皮。3. 权利要求1的方法，其中插入切割工具包括纵向切割胚轴以保留部分胚轴与每个子 叶节段在一起。4. 权利要求3的方法，其中在插入切割工具之前大豆种子工具的胚轴有一未切割长 度，且所述第一子叶节段的部分胚轴的长度是该大豆种子的胚轴的未切割长度的大约1/3 至 1/2。5. 权利要求4的方法，还包括切割所述第一子叶节段的部分胚轴至该大豆种子的胚轴 的未切割长度的约1/3至1/2的长度。6. 权利要求3的方法，其中在插入切割工具之前该大豆种子的胚轴有一未切割长度， 且所述第一子叶节段的部分胚轴的长度与该未切割长度相等。7. 权利要求1的方法，其中插入切割工具包括沿着该大豆种子的种脐纵向切割该大豆 种子。8. 权利要求7的方法，还包括定位该大豆种子的外表面上的种脐，并在插入切割工具 之前将切割工具相对于该大豆种子定向，使得切割工具与该种脐对齐。9. 权利要求8的方法，其中每个子叶节段包含部分种脐。10. 权利要求7的方法，其中该大豆种子具有延伸穿过所述种脐的纵轴，该纵轴将该 大豆种子分为第一侧和第二侧，该方法还包括在插入切割工具之前握住该大豆种子的第一 侧。11. 权利要求1的方法，其中插入切割工具包括在形成所述第一和第二子叶节段之前 将切割工具推进到该大豆种子的胚轴内。12. 权利要求1的方法，其中该方法还包括从经培养的经接种的子叶节段产生完整、能 育的大豆植物，其中该完整、能育的大豆植物包含所述转基因事件。13. 通过权利要求12的方法产生的完整、能育的大豆植物，其中该完整、能育的大豆植 物的转基因事件包括所述转基因事件。14. 权利要求12的方法，其中该方法还包括产生所述完整、能育的大豆植物的后代，其 中该后代植物包含所述转基因事件，并且该方法任选地包括从该后代植物产生大豆种子。15. 通过权利要求14的方法产生的后代植物，其中该后代植物包含所述转基因事件。16. 通过权利要求14的方法产生的大豆种子，其中该大豆种子从所述后代植物产生， 且该大豆种子包含所述转基因事件。17. 权利要求14的方法，还包括产生后代植物，该方法还包括下述步骤： (a) 使所述完整能育的大豆植物与另一大豆植物杂交， (b) 从步骤（a)的杂交收获后代种子，其中该后代种子包含所述转基因事件， (C)播种该后代种子， (d) 从该后代种子种植后代植物，该后代植物包含所述转基因事件，和 (e) 从步骤（d)中种植的后代植物产生后续的后代植物，该后续的后代植物包含所述 转基因事件。18. 权利要求1的方法，其中所述转基因选自下组：杀虫剂抗性基因、除草剂耐受性基 因、氮利用效率基因、水利用效率基因、营养品质基因、DNA结合基因、以及可选择标志物基 因。19. 一种产生转基因事件的方法，该方法包括： 将切割工具插入种子的种皮以产生包含部分胚轴的子叶节段， 用土壤杆菌接种该包含部分胚轴的子叶节段，所述土壤杆菌包含至少一个转基因， 培养该经接种的子叶节段而在经转化的植物细胞中产生转基因事件，以及 从该经培养的经接种的子叶节段产生完整、能育的植物，所述完整、能育的植物包含所 述转基因事件。20. 权利要求19的方法，其中所述种子是双子叶植物种子。21. 权利要求19的完整、能育植物的后代植物，该后代植物包含所述转基因事件。22. 从权利要求21的后代植物产生的种子，该种子包含所述转基因事件。23. 权利要求19的方法，其中将切割工具插入种皮形成第一子叶节段和第二子叶节 段。每个子叶节段包括部分胚轴。24. 权利要求18的方法，其中所述转基因包括pat,dgt-28或hpt可选择标志物基因。
【专利摘要】公开了一种用于土壤杆菌介导的大豆胚系转化的方法，包括用含有转基因的根癌土壤杆菌感染具有一部分胚轴的分割的(split)大豆种子。所述方法可以进一步包括在选择培养基上从转化的包含部分胚轴的切割大豆种子体外再生外植体。
【IPC分类】C12N15/82
【公开号】CN105264077
【申请号】CN201380073296
【发明人】D·帕雷迪, S·R·切纳雷迪, T·明尼克斯, O·卡尔波娃, D·格里芬, P·S·贾亚库马尔, K·史密斯, R·萨里亚-米兰
【申请人】美国陶氏益农公司
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2013年12月19日
【公告号】CA2895212A1, CA2895343A1, CN104869809A, EP2934094A1, EP2934094A4, EP2935592A1, US20140173774, US20140173780, WO2014100234A1, WO2014100406A1