孔板 中，每孔100 μ L，同时加入25 μ L化合物5或8的溶液，使其终浓度为20nM，在37°C和5% C〇2培养箱中培养2小时，用PBS洗去未粘附的细胞，弃去PBS后每孔加25 μ L浓度为5mg/ mL的MTT溶液，置于37°C和5% C02培养箱中孵育4个小时，小心除去上清液后每孔加入 100 μ L DMSO,振荡约lOmin溶解沉淀，立即于酶标仪570nm波长下检测0. D.(吸光度）值。 粘附抑制率的计算公式如下：粘附抑制率（％) = [1-(化合物8组细胞的0D值/空白组细 胞的0D值）]X 100 % ;实验数据统计均采用t检验和方差分析，粘附抑制率以均值土 SD % 表7K。
[0105] 5)结果见表5。由表5可以看出，在20nM浓度下化合物8能抑制HCCLM3细胞与 Fn粘附，粘附抑制率为20. 73%。与发明人公开的Leu-Asp-Val抑制SACC-LM细胞与ECM 及血小板粘附的有效浓度为1 μ Μ相比，化合物8的有效浓度降低了 50倍。
[0106] 表5化合物8的体外抗肿瘤细胞粘附活性
[0108] η = 5 ;a)与化合物 5 组比 ρ < 0· 01
[0109] 实验例5评价化合物5和8的体外抗肿瘤细胞侵袭活性
[0110] 1)化合物5和8用含0. 1 % DMSO的DMEM培养基配制成浓度为100 μ Μ的溶液。
[0111] 2)细胞为HCCLM3 (高转移人肝癌细胞）。
[0112] 3)基质胶为 matrigel。
[0113] 4)实验方法
[0114] 将冻存于_2(TC冰箱的基质胶matrigel4°C过夜，变成液态；取720μ L无血清 DMEM培养基，加入180 μ L Matrigel，混匀，加入至Transwell小室的聚碳酸酯膜上室， 100 μ L/个，放入37°C和5% C02培养箱中孵育5h。吸除小室中残留液体，每孔加入50 μ L DMEM培养基，37°C和5% C02培养箱中孵育30min。
[0115] HCCLM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为 5 X 105个/mL。每孔加入100 μ L细胞悬液，同时加入25 μ L同时加入25 μ L化合物5或8 的溶液，使其终浓度为20ηΜ。空白对照加25 μ L含0. 1 % DMSO的DMEM培养基配制的溶液。 下室加入600 μ L无血清DMEM培养基，在37°C和5% C02培养箱中培养48小时。
[0116] 用棉签擦去基质胶和上室内的细胞之后，用4%的多聚甲醛固定细胞30min。吸除 固定液，用PBS洗3次，用0. 1 %的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。
[0117] 将Transwell上室放入含有Lysis Buffer的6孔板中，室温放置lOmin,前后震荡 使结晶紫充分溶解，用酶标仪测量混合液的〇. D.值。
[0118] 侵袭抑制率=(1-给药组0· D.值/空白组0· D.值）X 100%
[0119] 实验数据统计均采用t检验和方差分析，侵袭抑制率以均值土SD%表示。
[0120] 5)结果见表6。可以看出，在20nM浓度下化合物8可抑制HCCLM3细胞对ECM的 侵袭，抑制率为28. 73%。与发明人公开的Leu-Asp-Val抑制SACC-LM细胞侵袭的有效浓度 为1 μ Μ相比，化合物8的有效浓度降低了 50倍。
[0121 ] 表6化合物8的体外抗肿瘤细胞侵袭活性
[0124] η = 5 ;a)与化合物 5 组比 p < 0. 01.
[0125] 实验例6评价化合物5和8的体外抗肿瘤细胞迁移活性
[0126] 1)化合物5和8用含0. 1 % DMS0的DMEM培养基配制成浓度为100 μ Μ的溶液。
[0127] 2)细胞为HCCLM3 (高转移人肝癌细胞）。
[0128] 3)实验方法
[0129] HCCLM3细胞消化之后，用无血清DMEM培养基洗3次，计数，配成细胞悬液，密度为 2 X 106个/mL。每孔加入100 μ L细胞悬液，同时加入25 μ L同时加入25 μ L化合物5或8 的溶液，使其终浓度为20ηΜ。空白对照加25 μ L含0. 1 % DMS0的DMEM培养基配制的溶液。 下室加入600 μ L无血清DMHM培养基，在37°C和5% C02培养箱中培养6小时。
[0130] 用棉签擦去上室内的细胞之后，用4%的多聚甲醛固定细胞30min。吸除固定液， 用PBS洗3次，用0. 1 %的结晶紫染液染色30min。吸除染色液，用PBS洗3次。
[0131] 在每个小室选取9个大致相同的视野观察，拍照，计数。实验数据统计均采用t检 验和方差分析，迁移的细胞数以均值土SD表示。
[0132] 4)结果见表7。可以看出，化合物8在20nM剂量下可抑制HCCLM3细胞迁移，抑制 率为20. 58%。与发明人公开的Leu-Asp-Val抑制SACC-LM细胞迁移的有效浓度为1 μ Μ相 t匕，化合物8的有效浓度降低了 50倍。
[0133] 表7化合物5和8的体外抗肿瘤细胞迁移活性
[0135] η = 9 ;a)与化合物 5 组比 p < 0· 01。
【主权项】
1. 下面结构的1-(4-异丙基苯基）-目-[?卡晰-3-甲醜-T;rp-T;rp-T;rp-Leu-Asp-Val。2. 权利要求1的1-(4-异丙基苯基）-目-巧晰-3-甲醜-T巧-T巧-T巧-Leu-Asp-Val的制备方法，该方法由W下步骤构成： (1) 在二氯亚讽（SOCU的存在下，k色氨酸和甲醇反应，生成k色氨酸甲醋； (2) 在Η氣醋酸存在下，在水中4-异丙基苯甲醒（枯茗醒）和心色氨酸甲醋缩合为 (3巧-1-(4-异丙基苯基）-1，2, 3,4-四氨-目-巧晰-3-駿酸甲醋； (3) 在二氧化砸（Se〇2)的存在下，（3巧-1-(4-异丙基苯基）-1，2,3,4-四氨-目-巧 晰-3-駿酸甲醋在二氧六环中氧化1-(4-异丙基苯基）-目-巧晰-3-駿酸甲醋； (4) 冰浴下在氨氧化钢的水溶液（2M)和甲醇中，1-(4-异丙基苯基）-目-巧晰-3-駿 酸甲醋转化为1- (4-异丙基苯基）-目-巧晰-3-駿酸； (5) 采用逐步缩合法，在N，N-二环己基碳二亚胺值CC)和N-居基苯并Η哇（册Bt)存 在下，在干燥四氨巧喃（THF)中反应，得到全保护多肤序列Boc-化p-化p-化p-OBzl; (6) 冰浴下在氯化氨的己酸己醋溶液中（4M)，全保护多肤序列Boc-化P-化P-化p-OBzl 脱除Boc得T巧-T巧-T巧-OBzl; (7) 在N，N-二环己基碳二亚胺值CC)和N-居基苯并Η哇（册Bt)存在下，1-(4-异丙 基苯基）-目-巧晰-3-駿酸在无水四氨巧喃（TH巧中与化P-Τ'巧-化p-OBzl缩合为1-(4-异 丙基苯基）-目-B卡晰-3-甲醜-T;rp-T;rp-T;rp-〇Bzl; (8) 冰浴下在氨氧化钢的水溶液（2M)和甲醇中，化合物1-(4-异丙基苯基）-目-巧 晰-3-甲醜-T巧-T巧-T巧-OBzl转化为1-(4-异丙基苯基）-目-ti卡晰-3-甲 醜-化P-T巧-T巧； (9) 采用逐步缩合法，在N，N-二环己基碳二亚胺值CC)和N-居基苯并Η哇（册Bt)存 在下，在干燥四氨巧喃中反应，得到全保护多肤序列Boc-Leu-Asp(OBzl)-Val-OBzl; (10) 冰浴下在氯化氨的己酸己醋溶液（4M)中，全保护多肤序列 Boc-Leu-Asp(OBzl) -Val-OBzl脱除Boc得Leu-Asp(OBzl) -Val-OBzl; (11) 在N，N-二环己基碳二亚胺值CC)和N-居基苯并H哇（册Bt)存在下， 1-(4-异丙基苯基）-目-巧晰-3-甲醜-T巧-T巧-T巧在无水四氨巧喃中分别与 Leu-Asp(OBzl) -Val-OBzl,缩合为 1-(4-异丙基苯基）-目-ti卡晰-3-甲醜-T;rp-T;rp-T;rp-Le u-Asp(OBzl)-Val-OBzl； (12) 在Pd/C/U存在下，在甲醇中化合物1-(4-异丙基苯基）-目-巧晰-3-甲醜 -T巧-T巧-T巧-Leu-Asp(OBzl) -Val-OBzl转化为1- (4-异丙基苯基）-目-巧晰-3-甲 酉先-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-V曰 1。3. 权利要求1的1-(4-异丙基苯基）-目-巧晰-3-甲醜-T巧-T巧-T巧-Leu-Asp-Val的纳米结构。4·权利要求 1 的 1-(4-异丙基苯基）-β-B卡嘟-3-甲醜-Ti'p-Ti'p-Ti'p-Leu-Asp-Val在制备抗肿瘤药物中的应用。5.权利要求1的1-(4-异丙基苯基）-β-B卡嘟-3-甲酉先-Ti'p-Ti'p-Ti'p-Leu-Asp-Val在制备抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了1-(4-异丙基苯基)-β-咔啉-3-甲酰-Trp-Trp-Trp-Leu-Asp-Val。公开了它的制备方法，公开了它的纳米结构，公开了它的抗肿瘤作用，公开了它抗肿瘤细胞粘附侵袭和迁移的作用，阐明了它在医学中的应用。
【IPC分类】A61P35/00, A61K38/08, B82Y30/00, C07K1/06, C07K7/06
【公开号】CN105315341
【申请号】CN201410261536
【发明人】赵明, 彭师奇, 王玉记, 吴建辉, 王程荣
【申请人】首都医科大学
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2014年6月11日