ml的IL-4溶液和2-5%的自体血浆， 将CD14+细胞培养在T25培养瓶中，诱导CD14+细胞向DC细胞分化。定期进行观察，每隔 2~3天全量补液。
[0056] 实施例3抗原的提取
[0057] 将实施例1收集的血浆取出，采用截留分子量为300kDa的超滤管（型号： Amicon-Ultra-15,购至Millipore公司）浓缩血衆中的蛋白，具体为：
[0058] 1、将超滤管用Milli-Q水欲清洗两遍，除去超滤膜中微量的甘油；
[0059] 2、向Amicon? Ultra超过滤装置中加入不超过15mL的血衆样本；
[0060] 3、将盖好盖子的过滤装置放入离心机中；
[0061] 4、5000g离心15~60分钟，收集浓缩后的液体。
[0062] 5、将浓缩后的滤液再用截留分子量为60kDa的超滤管（型号：Amic〇n-Ultra-15， 购至Millipore公司）继续浓缩（浓缩步骤如1~4)，最后将超滤膜上的蛋白冲洗下来，即 得到含有抗原的蛋白浓缩液。
[0063] 采用BCA蛋白浓度测定试剂盒（购至碧云天公司）检测，结果表明，获得蛋白的浓 度为 3. 12mg/mL。
[0064] 实施例4 DC细胞的刺激和成熟
[0065] 以X-VIV0 15培养基培养DC至第5天，加入实施例3制得的含有抗原的蛋白浓缩 液，37°C，5% C02，饱和湿度培养48小时。获得负载癌胚抗原的DC细胞。
[0066] 对比例1现有技术制备负载癌胚抗原的DC细胞
[0067] -、分离单个核细胞：
[0068] 1、取结直肠患者的外周血，将抗凝管中的外周血转移到离心管中，400~500g离 心5~10min，离心结束后将上层血浆收集于另一支离心管中，用于提取抗原。
[0069] 2、将下层血细胞转移到50mL离心管中，以0. 01mol/L PBS液按1:1稀释吹打均 匀，加入淋巴细胞分离液，离心机2000r/min,离心30min。
[0070] 3、吸取单核细胞，以PBS洗涤后细胞沉淀加入5ml的含有10%自体血清 RPMI-1640培养基，37°C，5% C02饱和湿度培养箱中培养。
[0071] 二、单个核细胞向DC细胞分化
[0072] 1、取出分离并培养2h的单个核细胞备用。显微镜下观察可见瓶底有致密的细胞 层，说明单核细胞已贴壁。超净工作台内打开细胞培养瓶，以吸管吸弃培养基，并以预热的 10%自体血清RPMI-1640培养基加入培养瓶中轻轻摇晃以去除未贴壁的细胞，重复3次。
[0073] 2、培养瓶内加入4ml培养基，同时加入终浓度为40ng/ml的IL-4,及40ng/ml的 GM-CSF，加入青霉素-链霉素以防止细菌污染。放入培养箱37°C相对湿度90 %，5 % 0)2条 件下继续培养。
[0074] 3、细胞培养24h后再次换液。取悬浮的细胞继续在GM-CSF和IL-4的刺激下培养， 此后细胞培养每三天换液一次，获得DC细胞。
[0075] 三、DC细胞的刺激和成熟
[0076] 1、培养第6天加入肿瘤坏死因子-α (TNF-α)，促进DC细胞的成熟。
[0077] 实施例5负载癌胚抗原的DC细胞的增殖能力测定
[0078] 将实施例4和对比例1制得的负载癌胚抗原的DC细胞分别以X-VIV0 15培养基 重悬，并进行细胞计数；
[0079] 将DC细胞以2 X 103/ml的密度接种到96孔板中，实施例4和对比例1制备的细 胞各接种28个孔，每孔100 μ 1细胞悬液；
[0080] 37 °C，5 % C02，饱和湿度培养培养24h后，实施例3和对比例1分别取4个复孔消 化后进行细胞计数；
[0081] 以后每日取4个复孔消化后进行细胞计数，连续检测7天。
[0082] 将所得的细胞数绘制成生长曲线（见图1)。
[0083] 结果显示，实施例4制备的细胞增殖能力显著优于（p〈0. 05)对比例1.
[0084] 实施例6负载癌胚抗原的DC细胞的表面标志物表达
[0085] 实施例5细胞培养7天后，流式细胞术检测实施例4和对比例1制得的负载癌胚 抗原的DC细胞的表面标志物CD86 :具体方法为：
[0086] 取1X106个DC细胞；250g离心5min去上清；用含10%FBS的PBS溶液清洗2次； 避光加入CD86抗体2. 5 μ L室温孵育30min ;用含10% FBS的PBS溶液清洗2次；用500mL RPMI 1640培养基重悬细胞并过滤；
[0087] 上流式细胞仪进行检测，检测结果如图2-a~图2-b。
[0088] 由图2可知，实施例4制得DC细胞的⑶86+的表达率为95. 7% (图2-a)，而对比 例1制得DC细胞的⑶86+的表达率为86. 1 % (图2-b)，明显低于本专利DC细胞的⑶86+ 的表达率（P〈〇. 05)，且差异具有统计学意义。
[0089] 实施例7负载癌胚抗原的DC细胞肿瘤疫苗的制备
[0090] 将实施例4制得的负载癌胚抗原的DC细胞以生理盐水重悬，至细胞密度为 2 X 105/ml，加入质量分数为2 %的BSA。制得DC细胞肿瘤疫苗。
[0091] 对比例2负载癌胚抗原的DC细胞肿瘤疫苗的制备
[0092] 将对比例1制得的负载癌胚抗原的DC细胞以生理盐水重悬，至细胞密度为 5 X 105/ml，加入质量分数为5 %的BSA。制得DC细胞肿瘤疫苗。
[0093] 实施例8 DC细胞疫苗治疗PBMC杀伤结直肠癌细胞的效果观察
[0094] 对实施例1和对比例4制得的DC疫苗和成熟的CIK细胞分别进行SW620细胞（由 暨南大学生物医药研究基地惠赠）、HCT116细胞（由暨南大学生物医药研究基地惠赠）和 HT-29细胞（由暨南大学生物医药研究基地惠赠）这三种结直肠癌细胞株的杀伤活性检测。 方法为：
[0095] 以CCK-8法测细胞杀伤率。SW620细胞、HCT116细胞和HT-29细胞作为靶细胞，分 别将实施例7和对比例2制得的疫苗以1:10的比例与CIK细胞共培养48h，成为效应细胞。
[0096] 打开超净工作台，将培养瓶中的靶细胞取出，贴壁生长的细胞可使用0. 25%胰酶 消化，吸管吹打成为细胞悬液，将之移入离心管l〇〇〇r/min，离心10min。弃上清，细胞沉 淀重悬，台盼蓝活细胞计数后调整至1X 106/ml。
[0097] 吸取100 μ L靶细胞加入96孔细胞培养板，按效靶比1:10,1:20,1:40加入效应细 胞，总体积调整为200 μ L。同时每个细胞浓度设置单纯靶细胞孔与单纯效应细胞孔，每样 设3个复孔.
[0098] 3)放入培养箱内培养48h后每孔加入CCK-810 μ 1，继续孵育2h后上酶标仪， 450nm读取0D值，计算杀伤率：
[0099] 杀伤率=[1-(共培养孔0D值-刺激细胞孔0D值）]/靶细胞孔0D值X 100 %。
[0100] 结果如表1 :
[0101] 表1对结直肠癌细胞的杀伤效果
[0103] *示具有显著性差异，ρ〈0· 05, **示具有显著性差异，ρ〈0· 01
[0104] 如表1，与对比例2相比，本发明实施例7提供的疫苗对结直肠癌细胞的杀伤效果 更好，效果具有统计学意义。
[0105] 以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来 说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为 本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种负载癌胚抗原的DC细胞制备方法，其特征在于，包括： 步骤1 :分离自外周血中CD14+细胞； 步骤2 :使所述CD14+细胞分化为DC细胞； 步骤3 :分离癌症患者血浆中分子量为60kDa~300kDa的蛋白； 步骤4 :以所述分子量为60kDa~300kDa的蛋白刺激所述DC细胞，制得负载癌胚抗原 的DC细胞。2. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述分子量为60kDa~ 300kDa的蛋白为CEA。3. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述刺激所用分子量为 60kDa~300kDa的蛋白浓度为 50μg/mL~60μg/mL。4. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中所述刺激的时间为48h。5. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤1中所述分离采用磁珠法。6. 根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中所述分化的诱导剂为 GM-CSF和IL-4。7. 权利要求1~6任一项所述制备方法制备的负载癌胚抗原的DC细胞。8. -种DC细胞肿瘤疫苗，其特征在于，包括权利要求1~6任一项所述方法的负载癌 胚抗原的DC细胞。9. 根据权利要求8所述的DC细胞肿瘤疫苗，其特征在于，还包括生理盐水和BSA。 1 〇.权利要求8~9任一项所述的DC细胞肿瘤疫苗作为治疗消化道癌症或呼吸道癌症 的药物的应用。
【专利摘要】本发明涉及细胞免疫技术领域，尤其涉及一种负载癌胚抗原的DC细胞及一种DC细胞肿瘤疫苗。本发明通过超滤富集癌症患者血浆中分子量为60kDa～300kDa的蛋白，该蛋白中主要包括CEA；将该蛋白用于刺激DC细胞成熟，使DC细胞负载癌胚抗原，负载癌胚抗原后的DC细胞增殖效果更好，且能够刺激CIK细胞对结直肠癌细胞株产生杀伤作用，且该效果优于现有技术制备的DC细胞肿瘤疫苗。因此，本发明提供方法制备的负载癌胚抗原的DC细胞能够制备肿瘤疫苗用于治疗癌症，特别是结直肠癌。
【IPC分类】A61P35/00, C12N5/0784, A61K39/00
【公开号】CN105316292
【申请号】CN201510889345
【发明人】陈海佳, 葛啸虎, 王一飞, 罗二梅, 张维敏
【申请人】广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年12月4日