3.54(1!1，(1(1，了= 8.0， 6. 5Hz，H-9'b)〕，一个亚甲基[δΗ2· 63(lH，dd，J= 13. 0,4· 5Hz，H-7a)和 2. 54(lH，dd，J= 13. 0,4· 5Hz，H-7b)]和两个次甲基[δΗ2· 16(1H，m，H-8)和 2. 45(1H，m，H-8'）]。13CNMR 谱显示有21个碳信号，其中包括两个芳环的12个芳香碳，两个含氧次甲基[δC105. 5 (C-9) 和 76. 3(C-7'）]，一个含氧亚甲基[δC68. 2(C-9'）]，三个甲氧基[δC54. 8(3-0CH3)， 54. 7 (3 ' -0CH3)和 52. 6 (9-0CH3)]，二个次甲基[δC48. 1 (C-8 '）和 48. 6 (C-8)]，以及一个亚 甲基[δC33. 9 (C-7) ]。H-8和H-9之间较大的耦合常数（4. 5Hz)，表明两者是顺式的。NOESY 谱中H-8与H-9和H-7' ;H-7与H-8'和的相关性表明C-7'，C-8，C-8'以及C-9的绝对构型 分别为S，R，R，S。综合氢谱、碳谱、HMBC谱和NOESY谱，以及文献关于相关类型核磁数据， 可基本确定该化合物如图1所示，立体构型进一步通过ECD试验确定，理论值与实验值基本 一致（图2)。
[0026] 实施例2 :化合物（I)药理作用试验
[0027] -、材料和仪器
[0028] 786-0肾癌细胞株、0S-RC-2肾癌细胞株均购自中科院细胞库。化合物（I)自 制，HPLC归一化纯度大于98%。RPMI-1640培养基、100U/mL青霉素及100μg/mL链霉素、 1XPBS缓冲液、胰酶-EDTA购于美国HyClone。胎牛血清购于美国Gibco。细胞增殖与毒性 检测试剂盒（中国）。基质胶购于美国BDBioscience。
[0029] HERAcell240i恒温孵箱、GmbHD-37520低温离心机、1510酶标仪为芬兰Thermo公 司产品。頂T-2倒置相差显微镜为日本Olympus公司产品。DFC480正置显微镜为德国徕卡 公司产品。MDF-U53V-80°C超低温冰箱为日本SANYO公司产品。YDS-50B-80液氮储存罐购 自中国成都液氮容器厂。BC-185GE4°C冰箱为中国益友公司产品。Minispinplus小离心机 为Eppendorf公司产品。powerpac300电泳仪为美国Biorad公司产品。Las4000mini凝胶 成像仪为日本FUJIFILM公司。
[0030] 二、试验方法
[0031] 1、细胞培养
[0032] (1)常规培养及细胞传代：786-0及0S-RC-2肾癌细胞株均培养在改良型 RPMI-1640培养基中，常规培养时加入了 10%胎牛血清及1%青霉素和链霉素，构成完全培 养基。培养条件为37°C、5%C02的恒温培养箱。正常情况下786-0及0S-RC-2细胞均为贴 壁生长。每天在倒置相差显微镜下观察细胞生长情况，一般隔天换液一次。换液时先吸去 培养瓶或培养皿中培养基，加PBS洗漆2次后再加入完全培养基。细胞密度达到80-90 %且 细胞形态仍保持良好时进行传代，传代周期一般为3天。细胞传代步骤如下：1)先弃去培养 瓶内培养基，PBS洗2次；2)培养瓶内加lmL胰蛋白酶-EDTA，37°C孵育约3分钟，倒置显微 镜下观察细胞变圆并脱落后，加入3mL完全培养基终止消化，并用吸管将成团的细胞吹散； 3)细胞悬液移至15mL离心管中，1000转/分离心5分钟，弃去上清，加入完全培养基吹散 细胞沉淀，分装到3个培养瓶中，置于37°C、5%C02中继续培养。
[0033] (2)细胞冻存：细胞处于对数生长期，状态良好并且细胞密度达到80-90 %冻存细 胞，步骤如下：1)配制细胞冻存液：将改良型1?^1-1640培养基、胎牛血清、0130按7 :2:1比 例混合、震荡混匀；2)消化、离心细胞（具体见细胞传代步骤）；3)离心后吸去上清液，加入 冻存液并吹匀，调整细胞计数约1X107mL，移至1. 2mL冻存管中。在冻存管标记冻存日期及 细胞株信息，用封口膜封口。置于4°C冰箱30分钟，移至-20 °C冰箱2小时，再移至-80 °C冰 箱过夜，次日转入液氮中保存。
[0034] (3)细胞复苏：1)水浴锅预热到37°C准备；2)从_80°C冰箱或液氮中取出细胞，迅 速放入37°C的水浴锅中并摇动，使其内液体在1-2分钟内融化；3)将融化后的细胞悬液移 置15mL离心管中，1000转/分钟离心5分钟，离心后弃去上清并加入完全培养基。4)将细 胞置于37°C、5%C02培养箱中培养，次日观察细胞状态并换液。
[0035] (4)细胞计数：1)细胞消化，吹散制备细胞悬液，方法同细胞传代。用加样器吸取 20μL悬液沿盖玻片边缘烧靠外侧滴加，使悬液由于气压影响均匀吸入计数察，健康活细胞 呈规则圆形、透明状。计算计数板4个角的4大格内细胞数（格子边线上的细胞只记上边、 不计下边；只记左边、不记右边）。细胞密度=4大格细胞总数Χ0. 25Χ107mL。
[0036] 2、细胞增殖曲线绘制
[0037] (1)当786-0及0S-RC-2细胞处于对数生长期，密度80-90 %时，制备细胞悬液并 细胞计数，方法同上。调节细胞悬液浓度为1X105/mL; (2)接种细胞悬液lmL接种于于24 孔板上，然后再根据不同条件加药，保证每孔细胞数基本一致。同一种细胞同一种加药条件 设计计数6天，每天计数3个孔，即每种条件需设置18个孔；（3)将培养板置于37°C、5 %C02 中培养；(4)从接种次日开始计数，记为第1天（第0天细胞数记为接种细胞数，即1X105)。 每孔加200μL胰酶-EDTA，消化、吹散、计数即可。每隔24小时取3个孔进行细胞计数；（5) 根据计数所得数据绘制细胞生长曲线。
[0038] 3、WST-8细胞活力实验
[0039] (1)收集对数生长期的786-0及0S-RC-2细胞，制备细胞悬液、细胞计数，方法同 上。调节细胞悬液浓度为4X104mL; (2)每孔中加入50μL细胞悬液（即2000个细胞/ 孔），然后各逾加入含有设计值2倍浓度药物的完全培养基50μL混勾，这样使药物终浓度 恰好为设计值，且保证了各孔细胞数的一致性。每个条件设置5个复孔；（3)将细胞置于 5%C02、37°C条件下的细胞培养箱中孵育；(4)分别在24小时和48小时后终止培养，吸取 孔内培养基，更换新鲜完全培养基，每孔加入10μLWST-8溶液，用加了新鲜完全培养基和 WST-1溶液但没有接种细胞的孔作为空白对照；（5)避光条件下置于摇床5分钟摇勾，后继 续放入37°C、5%C02条件下培养箱中培养1小时；(6)酶标仪下测定450nm吸光度值；(7) 细胞活性抑制率=(对照组吸光度值-实验组吸光度值）八对照组吸光度值/空白组吸光 度值）X100%。
[0040] 4、划痕细胞迀移实验
[0041] (1)准备无菌6孔细胞培养板，marker笔在6孔板背面每隔1cm划一道标线；（2) 取对数生长期细胞，PBS液洗漆2次，0. 25%胰蛋白酶消化、吹散，将细胞悬液离心，更换完 全培养基重悬。接种于标记好的6孔培养板中培养，每孔加5X105细胞；（3)37°(：、50)2培 养，待倒置相差显微镜下观察各孔细胞密度约达到90 %时吸取完全培养基，换用无血清培 养基培养24小时，以消除由于血清引起的增殖对迀移作用的干扰；(6)无血清培养到指定 时间后用高压消毒的200μL枪头垂直6孔板上的标记线划痕。划痕与孔板上mark笔上的 横线交叉点即为观察的固定点。（7)PBS清洗2次洗去划下的细胞。更换新鲜的无血清培 养基，按照实验条件在各组培养基中加入相应浓度的药物，同时设立对照组，置37°C、5C02 孵箱中培养；(6)每个孔取8个固定点观察划痕后12h、18h的细胞迀移情况并照相，使用 ImageJ图像分析软件测定每张图片划痕区的面积；(8)迀移率=(观察时间固定点划痕面 积-起始时间固定点划痕面积）/起始时间固定点划痕面积χ100%。迀移抑制率=(实验 组迀移率-对照组迀移率）/实验组迀移率X100 %。
[0042] 5、Transwell细胞侵袭实验
[0043] (1)取培养在完全培养基中的对数生长期786-0和0S-RC-2肾癌细胞株，PBS洗 漆2次，换用无血清的RPMI-1640培养基培养12小时，以减少细胞增殖对侵袭实验的影 响；（2)准备Transwell小室。小室可搭置于24孔细胞培养板上，底面为直径6. 5mm、孔 径5μπι的膜。取40μL以1:5稀释的lmg/mL基质胶铺在上室，并放入4°C过夜风干，该 操作需在冰上完成，因基质胶在室温下易迅速凝固；（3)786-0和0S-RC-2肾癌细胞株经 无血清RPMI-1640培养基培养到12小时后，胰酶-EDTA消化、离心后吸去上清，加入无血 清的RPMI-1640培养基重悬，细胞计数调整细胞浓度至lX106/mL;(4)将准备好的带有 Transwell小室的24孔板取出，下室（即24孔板的孔）中加入500μL含有10%胎牛血清的 完全培养基，以提供对细胞的趋化作用。将上室搭在孔上，此时可见上室底面的膜刚好浸在 了下室中的培养基里。观察下室的培养基与上室底面的膜之间没有气泡即可；（5)取50μL 细胞悬液加在各个孔的上室，再加入含有不同浓度药物的无血清RPMI-1640培养基50μL， 使各