个孔上室药物的浓度达到实验设计浓度。观察各孔中没有气泡；(6)将细胞放入37°C、 5C02的恒温培养箱中培养12小时，取出上室。用棉棒轻柔擦拭小室膜的上面，将没有穿过 膜的细胞擦掉；（7)将小室用PBS轻柔冲洗，洗去表面的培养基；（8)将小室放入95%乙醇 中固定10分；(9)用PBS轻柔冲洗小室表面的固定液，再将小室放入苏木素中染色5分钟； (10)小室放入1 %盐酸酒精中分化，自来水冲洗返蓝5分钟；（11)将小室放入伊红中染色5 分钟，然后自来水冲洗；（12)小室依次放入75%乙醇1分钟、85%乙醇1中分钟、95%乙醇 1中分钟、100%乙醇4分钟；（13)将小室风干，用刀片小心沿边缘切下小室底面的膜。膜底 面朝上放在盖玻片上，中性树胶封片；（14)在正置显微镜下观察，每张片在200X下取8个 随机视野，数出每个视野中穿过的细胞数，进行统计分析，进行统计学分析。
[0044] 6、统计分析
[0045] 应用SPSS20. 0(IBMInc，USA)软件处理数据，所有数据用i±s表示。多组间差异比 车父米用单因素方差分析，两两间比$父米用Dunnett-t检验，两组间比$父差异米用student-t 检验。检验水准a= 0.05。
[0046] 三、结果及结论
[0047] 1、化合物（I)对肾癌细胞株786-0和0S-RC-2增殖能力的影响
[0048] 生长曲线显示加入不同浓度的化合物（I)后，两种肾癌细胞株的增殖都受到了 明显的抑制。0.1mg/mL化合物（I)作用于786-0细胞24小时即出现显著的抑制生长作 用（Ρ〈0·035)。随着培养时间的延长，O.lmg/mL化合物（I)及0.25mg/mL化合物（I) 对细胞增殖保持明显的抑制作用，而〇.5mg/mL化合物（I)使786-0细胞的增殖停滞。化 合物（I)对OS-RC-2细胞的增殖同样有抑制作用，在培养第3天0.lmg/mL、0. 25mg/mL、 0. 5mg/mL表现出对OS-RC-2细胞的显著抑制（P分别为0. 026、0. 004、0. 002)。绘制的生长 曲线显示化合物（I)对786-0细胞株的增殖抑制作用较对OS-RC-2细胞的增殖抑制作用 更为明显。生长曲线周期中每天的细胞增殖情况见表1 (注：*在相应作用时间与对照组相 比有统计学差异（P〈〇. 05))。
[0049] WST-8细胞活力实验结果显示，化合物（I)对肾癌细胞株786-0细胞及OS-RC-2 细胞活力均有明显的抑制作用，化合物（I)0.1mg/mL即在24小时对786-0及0S-RC-2细 胞的活力有显著的抑制作用，且与对照组比较差异有统计学意义。药物在24小时对两种细 胞的半数抑制浓度（IC5。）分别为3. 5mg/mL和16. 45mg/mL，在48小时分别为为0. 165mg/mL 和1. 762mg/mL。对两种细胞的活性抑制作用见表2(注：*在相应作用时间与对照组相比有 统计学差异（P〈〇.〇5))。
[0050] 2、化合物（I)抑制肾癌细胞株迀移和侵袭能力
[0051] 细胞划痕迀移实验结果显示，化合物（I)对肾癌细胞株786-0和0S-RC-2的迀 移能力有抑制作用，化合物（I)〇.25mg/mL组在6h、12h、18h对786-0迀移的抑制率为 10. 95%、21. 96%和43. 02%，12h和18h的差异有统计学意义（P值分别为0. 004和0. 000); 对0S-RC-2的抑制率为3. 81%、19. 67%、28. 44%，12h和18h的差异有统计学意义（P值 分别为0.009和0.000)。化合物（1)0.511^/1^组在611、1211、1811对786-0的抑制率为 76. 82%、81. 18%、和82. 62%，差异均有统计学意义（P值分别为0. 001、0. 000和0. 000); 对0S-RC-2细胞的抑制率为22. 01 %、52. 95 %、和61. 50 %，12小时和18小时的差异均有统 计学意义（P值分别为〇. 〇〇〇和〇. 〇〇〇)。各组在对应时间的迀移率如表3。
[0052] Transwell细胞侵袭实验结果显示，经过12小时后，786-0细胞株加药组（0· 25mg/ mL化合物（I))和对照组每个200X视野穿过的细胞数分别为262. 38±22. 13和 74. 75±10. 50,差异有统计学意义（P= 0. 000) ;0S-RC-2细胞株则分别为102. 75±8. 75、 65. 13±9. 66,且差异有统计学意义（P= 0. 000)。
[0053] 结论，本研究结果表明一定浓度的化合物（I)对肾癌细胞的增殖、迀移、侵袭、死 亡都有显著地影响，且在这些实验中对786-0细胞系的作用明显比对0S-RC-2细胞系更为 明显。表明这种药物也有可能通过这一机制对控制肾癌的进展和转移发挥一定的作用。
[0054] 表1化合物（I)对肾癌细胞株786-0和0S-RC-2增殖能力的影响
[0055]
[0056] 表2化合物（I)对肾癌细胞株786-0和0S-RC-2抑制率的影响
[0057]
[0058] 表3化合物（I)对肾癌细胞株迀移和侵袭能力的影响
[0059]
[0060] 实施例3
[0061] 片剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、或 柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂重量比为 1:7的比例加入赋形剂，制粒压片。
[0062] 实施例4
[0063] 口服液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规口服液制法制 成口服液。
[0064] 实施例5
[0065] 胶囊剂或颗粒剂的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如 酒石酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按其与赋形剂 重量比为1:7的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂。
[0066] 实施例6
[0067] 注射液的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石酸、 或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，按常规加注射用水，精 滤，灌封灭菌制成注射液。
[0068] 实施例7
[0069] 无菌粉针的制备：按实施例1方法先制得化合物（I)，以及利用有机酸如酒石 酸、或柠檬酸或甲酸或乙二酸等、无机酸如盐酸或硫酸或磷酸制成的盐，将其溶于无菌注射 用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于安瓿中，低温冷冻干燥后无菌 熔封得粉针剂。
[0070] 上述实施例的作用在于说明本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护 范围。本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换， 而不脱离本发明技术方案的实质和保护范围。
【主权项】
1. 具有下述结构式的化合物（I ):2. 权利要求1所述的化合物（I )的制备方法，其特征在于包含以下操作步骤：(a) 将淫羊藿的干燥地上部分粉碎，用70~80%乙醇热回流提取，合并提取液，浓缩至无醇味， 依次用石油醚、乙酸乙酯和水饱和的正丁醇萃取，分别得到石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物 和正丁醇萃取物；(b)步骤（a)中正丁醇取物用大孔树脂除杂，先用10%乙醇洗脱6个柱 体积，再用70%乙醇洗脱8个柱体积，收集70%洗脱液，减压浓缩得70%乙醇洗脱浓缩物； (c) 步骤（b)中70%乙醇洗脱浓缩物用正相硅胶分离，依次用体积比为40:1、20:1、10:1和 5:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到4个组分；（d)步骤（c)中组分4用正相硅胶进一步 分离，依次用体积比为8:1、5:1和2:1的二氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到3个组分；（e)步骤 (d) 中组分2用十八烷基硅烷键合的反相硅胶分离，用体积百分浓度为70%的甲醇水溶液 等度洗脱，收集8~12个柱体积洗脱液，洗脱液减压浓缩得到纯的化合物（I )。3. 根据权利要求2所述的化合物（I )的制备方法，其特征在于：所述用乙醇热回流 提取采用的乙醇浓度为75 %。4. 根据权利要求2所述的化合物（I )的制备方法，其特征在于：所述大孔树脂为AB-8 型大孔吸附树脂。5. -种药物组合物，其特征在于：其中含有治疗有效量的权利要求1所述的化合物 (I )和药学上可接受的载体。6. 权利要求1所述的化合物（I )在制备治疗肾癌的药物中的应用。7. 权利要求5所述的药物组合物在制备治疗肾癌的药物中的应用。
【专利摘要】本发明公开了一种新的木脂素类化合物及其制备方法和医药用途，属于药物技术领域。该化合物为首次报道，是一种结构新颖的木脂素类化合物，可以从淫羊藿的干燥地上部分中提取、分离纯化得到。体外试验证明该化合物对肾癌细胞的增殖、迁移、侵袭、死亡都有显著地影响，可以用来开发成治疗肾癌的药物。
【IPC分类】A61P35/00, C07C41/34, A61K31/09, C07C43/23
【公开号】CN105330521
【申请号】CN201510690657
【发明人】高忠青
【申请人】淄博夸克医药技术有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年10月22日