疫苗涉及外源因子污染的风险，微生物如细菌、真菌、支原 体、螺旋体、立克次体、病毒、原虫等有可能在生产过程中或原辅料添加的工艺步骤中引入 到原液、半成品、成品中，在本发明中，通过纯化，MDCK细胞蛋白残余量< 30ng/ml、MDCK细 胞DNA残余量< 100pg/ml。对人或动物更加安全，特别是过去不能注射流感疫苗的幼小禽 或特殊种群安全有效。考虑到生产过程中外源因子污染的风险和一些化学物质添加物残余 可能的安全风险，发明提供了大量的安全检验方法。也提供了细胞流感疫苗生产过程的关 键指控点。
[0058]MadinDarbyCanineKidney(MDCK)细胞成为流感疫苗包括禽流感疫苗基质，传 代细胞生产疫苗，世界动物卫生组织0IE和国内兽药质控部门没有明确规程，本发明参照 世界卫生组织WHO、美国药品食品监督管理署、中国的药典要求，对流感病毒纯化工艺进一 步改进，加强了工艺以及指控方法验证，从疫苗指标上达到国际标准并建立了标准。
[0059]MDCK传统上用于实验室流感病毒的滴定，来自ATCC，MDCK(CCL-34)，其有可能致 癌且培养需要高浓度血清、培养流感病毒滴度低，不适合规模化的流感抗原生产，优选的， 本发明所用100(细胞为1?0(-21^012，其菌种保藏编号为<610：如.6210，保藏日期为 2012年6月14日，已记载在专利号为ZL201210224401.6,发明名称为"适应全悬浮无血清 培养的MDCK细胞系及其在培养流感病毒、生产流感病毒疫苗中的应用"的专利申请中，禽流 感病毒液为由该细胞进全悬浮培养而成。
[0060] 生物反应器培养MDCK-ZL2012和流感病毒，1毫升培养原液的MDCK细胞蛋白达到 lmg/mL，MDCK细胞DNA水平超过10μg/mL，超出国际上安全疫苗的要求，如禽流感、狂犬病、 甲型肝炎以及人用流感疫苗标准。由于疫苗生产过程中外源因子污染风险的存在，需要每 批次大量的安全试验和安全评估，需要从鸡胚组织规模化生产流感疫苗到细胞规模化生产 流感疫苗工艺转化和质量控制的转化，也需要降低外源因子污染风险和去除大量的宿主细 胞杂质使其最小化。
[0061] 硫酸纤维素肝素亲和层析可用于某些病毒液的纯化，如乙型肝炎、丙型肝炎的小 量实验室纯化，中试规模或工业化生产如5000L-10000L的病毒培养液纯化特别是现行的 鸡胚流感疫苗纯化方法难以满足细胞流感疫苗的规模化要求。因为流感病毒糖蛋白和配体 的有力结合，需要剧烈洗脱，导致流感病毒活性和完整结构丧失，因此亲和层析配体、介质、 配体密度、配体偶联方式需要精心设计，使流感病毒和配体有效结合和洗脱，获得到完整、 有活性的流感病毒颗粒。本发明中，提供了规模化亲和层析纯化制备MDCK细胞培养灭活禽 流感全病毒疫苗方法，保证了疫苗的纯度。本发明提供可在位灭菌和预消毒的层析柱。一 般地禽流感疫苗生产，早期工艺收获后澄清阶段使用非特异性的核酸酶，如Benzonase，消 除了MDCK细胞潜在的风险。本发明在纯化过程中，加入核酸酶的产物用直向流过滤除去病 毒培养物的细胞和碎片，过滤液用切向流浓缩后进入下一步纯化步骤，一般再经离子交换、 分子筛、曲带密度离心、透析步骤，或者经分子筛、离子交换、超滤透析的步骤，本发明用一 步亲和层析代替了上述步骤，是本发明的特征之一。
[0062]用本发明的方法制备的纯化病毒液经超滤透析和除菌过滤、乳化、分装。透析缓 冲液含有蔗糖6% (w/v)、单盐酸精氨酸1% (w/v)、一水谷氨酸钠0.05% (w/v)、水解明胶 (禽）0· 5 (w/v)、无水磷酸氢二钾1 % (w/v)以及磷酸氢二钾0· 25% (w/v)。
[0063] 在位检测和纯化过程的质控是本发明提供的特征，如病毒滴度检或抗原含量检 测，总蛋白和总核酸检测以确定病毒培养液中的杂质。
[0064] 纯化流感病毒的方法，特别是具有较高免疫原性禽流感病毒的纯化方法特点：
[0065] 1.处理上样量大满足工业化生产的流感病毒液处理，是亲和层析和疏水反应层析 的完美结合。有配体吸附禽流感病毒、达到部分浓缩；配体和介质结合，是医学允许的疏水 性芳香族带有苯基、PPG、丁基、己基的大分子，配体是生物大分子，肝素或硫酸乙酰肝素，相 对于流感病毒抗体为配体，造价和成本非常低。
[0066] 2.操作简单，洗涤固相介质、洗脱禽流感病毒；
[0067] 3.去除DNA和目标病毒以外的杂质能力强，核酸减少到0. 01 %，蛋白减少到 0. 1% ；
[0068] 4.目标病毒产量高，总蛋白达25μg/ml，适合新的注册的细胞培养流感疫苗世界 卫生组织和中国食品药品监督管理局的最新指南，宿主细胞DNA水平超过10ng/剂是不可 接受的，因此发明中应用了核酸酶极大减少了细胞DNA，Benzonase核酸酶处理大量减少病 毒原液中的大分子DNA，进一步降低疫苗的致癌风险。特别是对禽类流感病毒易感动物和 幼小的禽类。
[0069] 5.发明中的方法克服了目前已知禽流感疫苗生产工艺的瓶颈，可生产高活性、高 纯度的流感全病毒，在产量、工艺流程时间、纯度、费用都低于已知禽流感病毒纯化疫苗方 法，如蔗糖垫离心、分子筛层析以及非特异性离子交换层析。
[0070] 本发明的目的之二是提供根据以上任一项所述的方法制备得到的禽流感全病毒 颗粒标记疫苗。
[0071] 在本发明中，优选的，每毫升疫苗中总蛋白总量为20-72. 5μg/ml，禽流感病毒血 凝素含量为5-7μg/ml，内毒素含量< 10EU/ml，MDCK细胞蛋白残余量< 10ng/ml、MDCK细胞 DNA残余量< 100pg/ml、牛血清白蛋白残余量< 10ng/ml、甲醛残余量< 50yg/ml、Triton X-100残余量< 15yg/ml、抗生素残余量< 50yg/ml，禽流感M2蛋白残余量< 2ng/ml。
[0072] 更优选的，每毫升疫苗中总蛋白含量为12. 5μg/ml，禽流感病毒血凝素含量为 11. 5μg/ml，禽流感M2蛋白残余量为1. 9ng/ml，，MDCK细胞蛋白残余量为2. 5ng/ml、MDCK 细胞DNA残余量为25. 0pg/ml、牛血清白蛋白残余量为2. 5ng/ml、甲醛残余量为10. 6μg/ ml、TritonX-100残余量为2· 6μg/ml、抗生素残余量为10. 3μg/ml，内毒素含量为1. 5EU/ ml〇
[0073] 本发明提供的禽流感全病毒颗粒标记疫苗中禽流感病毒为均一完整病毒颗粒，效 力高，且纯度高，不含病毒培养中禽流感的非结构蛋白和不成熟的病毒颗粒、除去了异源动 物源性的外源蛋白、多肽、寡肽，有效降低了疫苗注射引起动物潜在过敏反应、致癌的风险， 降低了引起动物传染病如疯牛病、禽流感的潜在风险，也除去了抗生素，对动物食品安全和 贸易没有影响。
[0074] 本发明提供的禽流感标记疫苗中禽流感M2含量甚微，含高度纯化灭活完整禽流 感病毒颗粒，注入动物机体产生禽流感结构蛋白抗体或中和抗体，使动物产生较强的体液 免疫，检测动物体内M2蛋白的抗体，可区别动物禽流感病毒免疫和感染，成为一种高度安 全、高效的标记疫苗，发挥防控中的有效免疫和监测作用。
[0075] 更进一步的，本发明还提出了所述的禽流感全病毒颗粒标记疫苗在制备预防或治 疗动物流感药物中的用途。
[0076] 其中，所述的动物流感包括禽流感、猪流感、马流感、人流感以及犬流感。
[0077] 本发明提供的标记疫苗优选为水包油包水的佐剂乳化而成，能增强禽类动物对禽 流感病毒的全面免疫，即增强中和抗体生成、增强细胞免疫。
[0078] 本发明提供了 一种大规模制备高效、高纯度、高安全禽流感全病毒颗粒标记疫苗 的方法及其产品，涉及病毒学、免疫学、疫苗学和过程工艺学，特别涉及标记疫苗、组分以及 制法包括规模化禽流感病毒的纯化工艺、质量控制方法和指标。制法包括生物反应器全悬 浮培MDCK细胞和禽流感病毒疫苗生产种子批病毒，经过反复冻融、裂解或超声、离心、深层 过滤、亲和层析、在位核酸酶解、疏水反应层析、灭活、超滤透析、除菌过滤、稀释乳化配制， 可用于商用禽流感MDCK适应或减毒株的纯化，也包括在其他敏感细胞系增殖的各型或亚 型禽流感病毒。MDCK细胞系主要作为禽流感疫苗生产基质，用于各型或亚型的禽流感病毒 标记抗原制备。
[0079] 相较于现有技术，本发明的优点在于：
[0080] 1、本发明提供了纯化流感病毒的方法，简化了流感病毒的纯化步骤、通过纯化工 艺，纯化了流感病毒，进而可配制人或动物疫苗，如活疫苗或灭活疫苗，灭活疫苗用适宜浓 度的福尔马林溶液。本发明的疫苗配方是液体剂型，可在2-8°C田间保护疫苗不失效，即效 价稳定。
[0081] 按照发明提供的方法，制备生物制品，特别是疫苗，在发明实例中获得应用，控制 流感，包括预防、治疗和诊断。发明方法提供纯化流感病毒配制的疫苗，接种动物，特别是禽 类诱导的免疫反应是以纯化的禽流感病毒为主，通过纯化，使禽类的免疫副反应显著降低、 在母体抗体存在下效果显著，能对特种鸡群和鸡龄幼小鸡群免疫，填补了禽类的免疫空白 期，增加了疫苗的适宜群体和对象。20-30日龄（成为家禽特别是商品肉鸡的禽流感免疫空 白期，一旦感染病毒就会造成不可估量的损失）可免疫此类疫苗。
[0082] 2、提供标记疫苗抗原中总蛋白含量、有效完整标记抗原含量、禽流感病毒血凝素 含量，MDCK细胞蛋白残余量，MDCK细胞残余DNA量，M2蛋白含量，Triton-X-100残余量以 及内毒素含量，使小分子物质或化学物质降至最低，保证了疫苗的高效、标记、安全、稳定和 动物的安全性、因而保证动物性食品安全和人类的安全。
[0083] 通过纯化，使禽类的免疫副反应显著降低、在母体抗体存在下效果显著，能对特 种鸡群和鸡龄幼小鸡群免疫，填补了禽类的免疫空白期，增加了疫苗的适宜群体和对象。 20-30日龄可免疫此类疫苗。（成为家禽特别是商品肉鸡的禽流感免疫空白期，一旦感染病 毒就会造成不可估量的损失）。不含外源性的蛋白、多肽、寡肽，如果添加使用则都被大量除 去，降低了动物疫病的传播风险。发明提供的方法包括现代浓缩、超滤、纯化技术组合，工艺 流程合理，禽流感完整病毒收率高且纯度高，易于大规模化生产和质量控制。
[0084] 3、一般兽用流感疫苗含完整的流感病毒，有效剂量为动物实验的结果，其中的成 分没有精确定量，如半数鸡胚保护剂量1-100EID50,人的疫苗中含单价血凝素15微克。剂 量确定是在无佐剂条件下给药接种动物确定，结合动物年龄、性别、体重等体征、免疫时间、 其他临床因素进行调整。本发明的疫苗配方抗原有效抗原量则以血凝素含量确定。以禽类 动物的药学试验为主进行注射接种，包括肌肉、皮下、皮内注射。
[0085] 4、由于大规模的生产需要，流感疫苗原液的杂质需要使用一些核酸酶去除，在收 获病毒培养液或分离流感病毒的工艺中，需要将流感病毒和杂质特别是核酸进行分离和纯 化。核酸酶加入后需要澄清，澄清工艺中，一般用正向流、切向流过滤，用离子交换层析，再 经分子筛或离心。本发明提供的方法，采用亲和层析浓缩和纯化禽流感病毒，使核酸酶加入 消化和亲和层析融为一步。
[0086] 5、本发明中提供了新的宿主细胞MDCK残余去除的方法和质控方法，亲和层析和 疏水反应层析组合可大量去除MDCK细胞DNA。亲和层析纯化方法提高了流感病毒纯度、活 性。疏水反应层析是生物大分子分离的常用手段，是基于离子相互反应正交分离技术，受配 体种类、配体密度、所使用的盐、PH、缓冲液类型以及温度的影响。近几年用于质粒中核酸、 脂多糖内毒素的去除分离。因此本发明也提供了禽流感疫苗原液中内毒素的去除方法。 [0087] 实验证明，本发明的亲和层析和疏水反应层析的组合使总的病毒蛋白收获率达 55-76%，DNA去除下降到0. 01%，杂蛋白（牛血清白蛋白和MDCK蛋白）去除下降到0. 1%。 [0088] 本发明包括了纯化有生物活性禽流感病毒的方法，方法包括装载固相基质，连接 配体、洗脱步骤。包括禽流感病毒结合到疏水层析柱固相中，洗脱禽流感病毒。禽流感病毒 结合到亲和层析介质上，洗脱活性禽流感病毒。在结合到疏水反应层析之前结合亲和层析 介质介质上。疏水层析配体包括PPG、苯基，a丁基，或a己基ligand配体。发明包括有 活性的禽流感病毒结合到液相疏水反应层析（HIC)介质方法和禽流感结合到液相假性亲 和膜吸附层析介质的方法，包括洗脱禽流感病毒的方法且保持禽流感病毒的活性。包括先 结合到假性亲和膜吸附层析介质后结合到疏水反应介质或者反向结合。洗脱的禽流感病毒 原液1剂量含有少于10纳克DNA，减少0. 04-0. 01 %。
[0089] 亲和层析介质为硫酸乙酰肝素或肝素，最佳洗脱液为1. 7M的硫酸铵。疏水反应层 析中，禽流感病毒病毒的优化洗脱液为梓檬酸缓冲液。
[0090] 6、MDCK细胞无论全悬浮培养、微载体培养或是贴壁培养禽流感病毒，培养基中都 残余有动物源性的蛋白或酶，宿主细胞残余成分有DNA、核酸、蛋白质，工艺过程中的去污 剂、灭活剂以及抗生素，通过本发明的纯化方法能够最大限度的去处上述杂杂质，从而达到 降低动物群体过敏副反应以及动物长期、大量注射疫苗存在的潜在的致癌风险。禽流感病 毒抗原包括但不限于禽流感病毒H1-H18,N1-N11。
[0091] 7、疫苗中血凝素抗原精确定量为20-25μg/ml，可进行快速配制苗，克服过去根据 体内效力试验，按体积进行经验型配