M硫酸铵、50M磷酸二氢钾，pH，7. 4较为适合流感病毒 吸附。
[0144] 亲和层析和疏水HIC-phenyl层析柱组合，硫酸纤维素或肝素亲和柱上样和平 衡缓冲液为lOOmM柠檬酸pH7. 4,洗脱缓冲液含有1. 7M(NH4)2S04, 50mMK2HP04,pH7. 4， HIC-phenyl柱上样和平衡液与亲和膜吸附层析洗脱液一致，洗脱液为100mM柠檬酸，pH 7. 4,流速lml/min，禽流感病毒蛋白用ELISA测定，总的DNA检测方法按照试剂盒（DNA; Quant-iT.RTM.PicoGreen.RTM.assay)中的说明书进行，总的蛋白检测方法按照试剂盒 (P;Pierce.RTM.BCAproteinassay)中的说明书进行。试验3次，结果取平均值。
[0145] 亲和层析和疏水反应层析组合优化：
[0146] 层析的操作条件和上述相同，用同一系统和检测系统。澄清的病毒液分别透析到 100mM柠檬酸，pH7. 4或含50mM磷酸二氢钾、pH7. 4缓冲液中，含流感病毒4.65X107TCID5。/ mL，分别上样已经用lOOmM柠檬酸，pH7. 4或含50mM磷酸二氢钾、pH7. 4缓冲液平衡的硫酸 纤维素或肝素柱，用l〇〇mM柠檬酸，PH7. 4或含50mM磷酸二氢钾、pH7. 4缓冲液简短洗涤，洗 脱液合并后分别上样已经平衡的疏水层析柱，1〇〇禮柠檬酸，PH7. 4或含50mM磷酸二氢钾、 PH7. 4缓冲液洗脱收集病毒液、合并，用上述方法检测病毒液的组分。
[0147] 2批流感病毒原液、不同的缓冲液条件，硫酸纤维素、肝素亲和膜吸附层析和 HIC-phenyl、HIC-PPGresins组合纯化层析的操作条件和上述相同，用同一系统和检测系 统。澄清的病毒液分别透析到l〇〇mM柠檬酸，PH7. 4或含50mM磷酸二氢钾、pH7. 4缓冲液 中，含流感病毒4. 65X107TCID5Q/mL，分别上样已经用lOOmM柠檬酸，pH7. 4或含50mM磷酸 二氢钾、PH7. 4缓冲液平衡的硫酸纤维素或肝素柱，用lOOmM柠檬酸，pH7. 4或含50mM磷酸 二氢钾、PH7. 4缓冲液简短洗涤，洗脱液合并后分别上样已经平衡的疏水层析柱，lOOmM柠 檬酸，pH7. 4或含50mM磷酸二氢钾、pH7. 4缓冲液或1. 7M硫酸铵洗脱收集病毒液、合并，用 实例的方法检测病毒液的组分。
[0148] 结果：纤维素硫酸化依赖化学反应的温度，在35 °C、40 °C、45 °C纤维素硫酸 化程度分别为5. 5 %、9. 3 %、13 %。lml硫酸纤维素可吸附50ml的病毒液，病毒滴度 4. 65X107TCIDM/ml，吸附66 %的病毒，最后洗脱病毒收获率79-80%，而纤维素骨架结合 15%的DNA，吸附31 %的流感病毒。说明硫酸纤维素纯化流感病毒可提高收率。
[0149] 硫酸化温度的提高，改善了流感病毒的吸附，也增强了DNA吸附，硫酸化达5. 5重 量％时，吸附15%的起始DNA。纤维素和硫酸化纤维素和DNA分子反应模式不同，环化的 DNA、DNA的大小不同导致对纤维素和硫酸纤维素不同吸附，离子交换介质限制了MDCK细胞 双链DNA对弱阴或强阴离子的吸附。
[0150] 疏水层析反应的流感病毒结合动力性试验表明所有介质可吸附20ml流感 病毒液，含3. 7X109TCID5。病毒。肝素介质动力结合活性为结合6ml流感病毒液，含 1. 1X109TCID5。病毒，硫酸纤维素结合活性为50ml流感病毒液，含9. 3X10 9TCID5。病毒， 硫酸纤维素的高结合性通过实验确证，流感病毒液50ml、4ml纯化的收获率分别为79%、 81 %，为结合的流感病毒为22 %、23 %。因此9. 3X109TCID5。流感病毒颗粒未能吸附到介质 上，进入3-5微米介质颗粒的过滤。可以忽略非特异性的结合。
[0151] 2M氯化钠溶液导致流感病毒对乙基、苯基、己基配体的结合不足，因此发明中，流 感病毒原液经亲和膜吸附层析后，为能提高疏水层析的杂质去除分离水平，选择使用硫酸 铵和一系列不同的疏水配体试验，包括乙醚，聚丙二醇（poly-propyleneglycol(PPG))，苯 基，丁基以及己基。结果：PPG以及苯基为配体的层析液中无流感病毒颗粒检出（ELISA)，乙 醚、丁基、己基作为HIC-配体的层析液分别含3%、6%、7%的起始上样的病毒。苯基、丁基、 己基作为配体洗脱后的洗脱液中分别含有起始病毒量的84%、67%、63%。
[0152]疏水介质层析不吸附对DNA的几率分别为乙醚（75% )、PPG(64% )、苯基（58% )、 丁基（48%)、己基（53%)。和流感病毒共同洗脱的DNA，不同配体有所不同：乙醚（29%)、 PPG(13% )、苯基（19% )和己基（4% )。配体疏水性和n-alkyl链长度增长导致对DNA结 合能力的增强因而导致总DNA的减少。强疏水性的配体，如能结合48%、43%起始DNA的丁 基、己基不能达到工艺物料平衡，在再生工艺步骤去除。发明所提供的结果明显地揭示流感 病毒培养液的自由DNA的疏水性可用于亲和膜吸附层析去除纯化液中的残余DNA。.
[0153] 疏水层析中除乙醚结合2 %病毒液起始蛋白，其他配体都能大量结合病毒液蛋白， 洗脱液无蛋白检测到。应用的洗脱液在硫酸铵存在下，不能充分洗脱吸附在介质上蛋白，洗 脱液中的蛋白含量在检测限值（丁基，己基）到2% (PPG)。乙醚和苯基HIC-陪体中含 1%总蛋白。大量的在疏水层析吸附介质上的蛋白可在再生工艺或步骤中通过激剧冲洗除 去。因此PPG和苯基HIC和亲和膜吸附层析用作流感疫苗下游的纯化。
[0154] 2批流感病毒原液、不同的缓冲液条件，硫酸纤维素、肝素亲和膜吸附层析和 HIC-苯基、HIC-PPGresins组合纯化的结果，如下表2所示：.
[0155]表2
[0156]
[0157] 从试验中看出用磷酸钾盐、柠檬酸缓冲液洗脱流感病毒并无差别，且可能减少流 感病毒的凝聚，流感病毒收率分别为73%、77%、75%、71%，纯化流感液的0嫩分别为 5. 8%-2. 0%，4. 9%-4. 2%，各试验结果无显著差异，但流感病毒产量明显提高。肝素亲 和层析用磷酸钾、柠檬酸缓冲液纯化流感病毒的病毒收率为68%、71%、59%、68%，用磷 酸盐缓冲液的纯化液中有12 %、14%DNA，柠檬酸缓冲液洗脱的病毒纯化液有20 %的DNA和 蛋白一起洗脱。HIC-PPG、HIC-苯基柱上样澄清后病毒液与纯化假性亲和吸附膜的洗脱液 不同，纯化上步澄清的流感病毒液收获率分别为88%、84%，纯化假性亲和膜吸附层析纯 化后样品的流感病毒收获率58%、75%。可能是假性吸附膜层析大量病毒蛋白损失影响病 毒颗粒的吸附性。
[0158] 发明的实例发现磷酸钾盐和柠檬酸缓冲系统可作为纯化工艺的缓冲系统，对流感 病毒的收率影响非常小，硫酸纤维素膜亲和层析（SC-ΜΑ)/HIC-苯基组合收率最高达56%， 其次为肝素亲和层析（h印arin-MA)/HIC-苯基组合收率为50%，SC-MA/HIC-PPG组合收率 44%heparin-MA/HIC-PPG组合病毒收率35% ;SC-MA/HIC-苯基层析组合使DNA下降到起 始含量的〇· 01-0. 04%。
[0159] 疏水层析中，离子强度影响DNA的减少，heparin-MA以及HIC-苯基是流感 病毒适宜的分离纯化介质。硫酸铵浓度在0. 4 5M时，9 5 %DNA和9 2 %的流感病毒不 吸附在HIC-苯基介质上，浓度增加0. 6M、0. 85M、1. 0M、1. 25M、1. 5M、1. 7M时，分别有 43%，58%，63%，77%，85%和85%的病毒吸附到介质上，且在1.5M后，洗脱液无病毒颗 粒能检出，但含40 %的DNA，因此考虑到疏水层析的性质：40 %DNA吸附于介质，20 %随病毒 洗脱，约有80%的DNA去除。HIC-苯基介质在1. 5M硫酸铵的洗脱下，可去除大量DNA和杂 质。优化的硫酸铵浓度为1.7M。1.7M硫酸铵对流感病毒滴度影响经测定下降小，抗原损失 小。因此基于以上实例结果，禽流感标记疫苗规模化生产工艺流程、步骤质量控制点如图1 和图2。
[0160] 实施例4禽流感疫苗纯化工艺和质量控制方法
[0161] 总蛋白浓度检测：用BCA试剂盒检测（购自Pierce公司）、白蛋白标准品（BSA， Cat. #23209,购自ThermoFisher公司），该法已经验证的使用范围25-250μg/ml，检测限 值：8· 3μg/ml，定量限值：25μg/ml。
[0162] 流感病毒血凝素检测用夹心ELISA。
[0163] 滴度用在MDCK细胞上的50%感染剂量TCID50法检测，采用试剂盒（购自ECACC; Cat. #88020401，UK;2· 0X105个 /well)，细胞培养液含高糖DMEM培养（购自Invitogen公 司）含4mM谷氨酰胺（Cat.#G-3126-250GSigma-Aldrich，北京，中国），0. 1%庆大霉素 (Cat. #15710080,Invitrogen,北京，中国）and10%胎牛血清FBS(Cat. #3302-P280703,I nvitrogen,北京，中国），在37°C、5%二氧化碳孵箱培养。病毒液样品10倍稀释加入单 层MDCK细胞培养48小时，用固定液固定（1体积丙酮和2体积甲醇混合），加入兔抗流感 病毒多克隆抗体（用含1 %胎牛血清PBS1000倍稀释），加入抗兔过氧化物酶偶联IgG抗体 (1;10000 稀释），加入ACE底物（0.3mg/ml3-amin〇-9-ethyl_carbazole溶解于缓冲液含 0. 1M醋酸钠、0. 015%双氧水，pH5. 0)，依次分步洗涤，在显微镜下观察，计算TCID50。
[0164]MDCK细胞残余DNA、MDCK细胞双链DNA检测采用试剂Quant-iT PicoGreendsDNAreagent(购自美国生命公司），使用范围 4-1000ng/mL，用lambda DNA(Cat. #D1501,Promega公司产品）校验，使用缓冲液为lOOmM醋酸，工作范围4-1000ng/ mL,检测限值0· 66ng/ml;定量限值2. 36ng/ml，总DNA测定6-400pg/mL范围获得验证。
[0165]DNA定量用限值总DNA测试盒和工作站（Cat.#R9009,德国MDS公司产品）。样品 经DNA抽提，用调零液调整体积到500微升，105°C灭活15分钟，加入1000微升对单链DNA 有高亲和性生物素偶联蛋白、链霉素亲和素、脲酶偶联抗单链单抗的混合液，标准液和样品 37°C孵育1小时，移入工作站的孔中，通过生物素包被醋酸纤维膜吸附器过滤，用PBS缓冲 液（含0. 05%叠氮化钠、0. 05%吐温，pH6. 5)洗涤，继续高真空过滤直到各孔干燥，膜吸附 器移入限值读数仪（已经包被底物溶液500微升，含5M尿素、0. 05 %叠氮化钠、0. 05 %吐温 的PBS缓冲液，读数仪有光测感受器），尿素是样品的pH发生变化，所有样品测试3次。该 法用小牛胸腺DNA校验，用50pg的胸腺DNA作为参照物以便满足工艺过程纯化和半成品残 余检测。
[0166] 实施例5禽流感标记疫苗原液、半成品、成品M2蛋白的定量检测
[0167] 禽流感病毒全长M2蛋白按专利号为ZL201210241084. 9,发明名称为"一种制备甲 型流感病毒全长M2蛋白的方法"的中国专利申请所提供的方法制备和纯化。
[0168] 疫苗原液、半成品、成品的M2蛋白的定量ELISA检测：纯化M2蛋白抗体溶于纯水， 使5以8/1111，加100微升于96孔板37°(：过夜，用含10%马血清的？83在4°(：封闭211，洗涤3 次，加入100μ1的10倍稀释液待测样品在室温下作用lh，用PBST洗涤3次，再用HRP标记 的M2蛋白抗体（1:1000~1:5000稀释）室温下反应lh，加入HRP底物，反应20min，用1M 磷酸终止反应，0D值大于阴性平均值为阳性，用纯化的M2蛋白不同稀释度已知含量的M2蛋 白标准品重复获得的标准曲线比较，获得样品中M2含量。
[0169] 蛋白测定方法：中国药典2005版附录29VIB，外源性DNA残余量测定法：中国 药典2005版附录46IXB，抗生素残余量测定法，中国药典2005版附录45IXA，，游离甲醛 < 50μg/剂，中国药典2005版附录34VIL。
[0170] 分子排阻高压液相层析在线分析疫苗抗原纯度，在线的AIV病毒抽提液、原 液100微升、浓缩原液100微升、纯化液100微升注入分析型分子排阻层析柱（TSK-Gel PffcolumnG6000PW.sub.XL,particlesize17.mu. ,poresize1000.ANG. )(Tosho BiosciencesLLC.;Montgomeryvilie,Pa.)，平衡液PBS(无Ca2+orMg2+)平衡柱子， 流速lml/分，紫外光吸收值215nm，懦动栗采用Agilent1100?·附带ChemStation?软件 (AgilentTechnologiesInc.;PaloAlto,Calif. )〇
[0171] 血凝素含量检测按中国药典2005年版三部113页提供方法进行。
[0172]MDCK细胞残余DNA检测按中国药典2005版附录46IXB进行，MDCK宿主细胞蛋白 测定试剂