[0060] (1)样品总RNA的制备
[0061] 采用Trizol法提取饲料样品中的总RNA:无菌操作将经过充分粉碎混匀的饲料 25g放入含有225mL的灭菌生理盐水的灭菌广口瓶内，在低温条件下（4°C)以100转/分 的速度震荡1. 5个小时，配成10%的均匀稀释液。无菌操作对上一步制备的均匀稀释液进 行10倍递增稀释，选择3个以上适宜的稀释度稀释后的稀释液用于提取总RNA，在饲料稀释 液中迅速加入lmLTrizol试剂，按Trizol试剂盒（D9108A)说明书提取样品RNA，RNA提取 的步骤如下：
[0062]①向上述步骤的匀浆裂解液中加入氯仿（RNAisoPlus的1/5体积量，200L)，盖紧 离心管盖，用手剧烈振荡15秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）。 待溶液充分乳化（无分相现象）后，再室温静置5min。
[0063] ② 12,OOOg4°C离心 15min。
[0064] ③从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，S卩：无色的上清液、中间的 白色蛋白层及带有颜色的下层有机相。吸取上清液（通常取450L)转移至另一新的1.5mL 离心管中（切忌吸出白色中间层）
[0065]④向上清中加入等体积的异丙醇（450L)，上下颠倒离心管充分混匀后，在15~ 30°C环境中静置lOmin。
[0066] ⑤12,000g4°C离心lOmin。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。
[0067] 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入75%的乙醇lmL(切勿触及沉淀），轻轻上 下颠倒洗涤离心管管壁，12, 000g4°C离心5min后小心弃去乙醇（为了更好地控制RNA中 的盐离子含量，应尽量除净乙醇）。可再用75%的乙醇lmL清洗一遍。
[0068] 室温干燥沉淀5~10min(不可以离心或加热干燥，否则RNA将会很难溶解），加入 适量的RNase-free水（肠道通常取50L，细胞、细菌取20L)溶解沉淀，必要时可用移液枪轻 轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后置于冰上。
[0069] (2)RNA的浓度检测、稀释
[0070] ①背景的建立：取RNase-free水2L，在微量核酸蛋白检测仪NanoDrop2000上建 立空白；检测RNase-free水的RNA浓度，在±5ng/L为宜。
[0071] ②检测样品浓度：组织样品浓度两次检测浓度相差以不超过50ng/L为宜，两次测 量的平均值即为样品RNA浓度。
[0072] ③ 1. 7〈Α260/Α280〈2· 1 ;基因芯片附加条件：Α260/Α230>2· 0
[0073] ④RNA样品的稀释：
[0074] 取XL样品稀释，则无酶水添加量：无酶水体积Y=(原液浓度/600 - 1)*X(L)， 细胞、细菌样品一般不需要稀释。
[0075] ⑤稀释后再次检查RNA浓度，以600 ± 50ng/L为宜。
[0076] 确保完全消除RNA中的DNA污染，得到纯化的RNA样品，使用微量紫外分光光度 仪测定浓度，采用1. 〇%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，然后将样品保存于-80°C下备 用；
[0077] E、反转录扩增
[0078] 反应体系 10μL:2· 0μL5XPrimeScriptBuffer2(forRealTime)、0· 5μL PrimeScriptRTEnzymeMixI、0· 5μLRTPrimerMix、0· 5uLRandomPrimers(lOOuM)、 TotalRNA(〈500ng)，RNaseFreedH20 补足至 10. 0μL〇
[0079] 反转录扩增反应条件：将混匀的反应液放置在PCR仪中37°C保温15min后，85°C 加热5s最后将反转录成的cDNA降温至4°C保藏。合成的cDNA保存在-80°C冰箱中。
[0080] F、实时荧光定量PCR
[0081] PCR反应体系 25. 0yL:12. 5yL2XSYBRroPremixExTaq?，10ymol/L上、下游 引物各 〇· 5μL,cDNA模板 2· 0μL，dH209. 5μL。
[0082] 荧光定量？〇?反应参数：95°(：预变性31^11;95°(：变性308,64°(：退火308,72°(：延 伸45s，循环40次，每个样品重复3次，在4°C低温下保存。
[0083] 所述的干酪乳杆菌上下游特异性引物分别是：
[0084] 上游引物为：5 ' -TGCGGCGGTAAAGGTTG-3 '
[0085] 下游引物为：5 ' -CGTCTGTGTAGAAACTGCGAATG-3 '
[0086] 外标准品的制备和标准曲线的绘制
[0087] 外标准品的制备：提取含有以干酪乳杆菌模式菌株的目的基因的扩增片段的质粒 DNA，紫外分光光度计测定A值后，计算出拷贝数，进行10倍系列稀释，梯度稀释至109-102 拷贝数/uL的浓度，以此作为外标准品进行荧光定量PCR反应；
[0088] 标准曲线的绘制：以不同拷贝数的阳性模板的对数为横坐标，以PCR反应过程中 达到阈值的初始循环数（Ct)为纵坐标得到干酪乳杆菌的标准曲线，作为待测样品定量测 定的参照标准。
[0089] G、结果及判断
[0090] 以待测样品cDNA和标准品的DNA为模板，用干酪乳杆菌的种特异性引物，以相同 的体系同时进行干酪乳杆菌的目的基因片段的荧光定量PCR扩增，通过标准曲线和待测样 品的Ct值求出饲料样品中干酪乳杆菌的起始模板量。
[0091] 实施例4:
[0092] 试剂盒特异性检测：
[0093] 1)干酪乳杆菌定性检测的特异性验证：
[0094] 利用实施例3提供的引物及方法，对嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、 屎肠球菌、粪肠球菌、两歧双歧杆菌、动物双歧杆菌、大肠杆菌、阳性对照（含有目的基因的 质粒为模版）、干酪乳杆菌、添加有干酪乳杆菌的饲料；阴性对照（灭菌水）进行PCR扩增。
[0095] 结果显示：仅泳道1 (含有目的基因的质粒为模版），2 (干酪乳杆菌），3 (添加有干 酪乳杆菌的饲料）产生了特异性的415bp的扩增条带，而其他菌株均没有，表明本发明提供 的引物仅可特异性的检测干酪乳杆菌。同时有泳道3的扩增结果可知，本发明的提供的样 品预处理方法可很好的对干酪乳杆菌进行分离提取（图1)。
[0096] 2)干酪乳杆菌定量检测特异性验证
[0097] 利用实施例3提供的方法，以非同种菌做为参照菌株，对干酪乳杆菌定量检测进 行特异性验证。
[0098] 所用的参照菌株有：嗜酸乳杆菌；植物乳杆菌；保加利亚乳杆菌；粪肠球菌；屎肠 球菌；双歧杆菌；青春双歧杆菌。
[0099]结果判断：①循环阈值（Ct值）< 35，表明PCR过程中有目标DNA的扩增，可直接 判定为阳性；②待检样基因检测Ct值在32~40之间，应重做实时荧光PCR扩增；再次扩增 后的外源基因Ct值仍小于40,且曲线有明显得对数增长期，并且阴性对照、阳性对照和空 白对照结果正常，则可判定为阳性；再次扩增后外源基因Ct值大于40,且阴性对照、阳性对 照和空白对照结果正常，可判定为阴性。
[0100] 结果表明：在模板为不同菌株DNA，引物为干酪乳杆菌特异性引物的条件下，仅在 模板为干酪乳杆菌DNA条件下，才能得到具有明显对数增长期的扩增曲线，即干酪乳杆菌 定量检测具有特异性（图2)
[0101] 实施例5:
[0102] 试剂盒灵敏性检测：
[0103] 将干酪乳杆菌在培养基中培养一定时间，测其A值，估计其菌数，然后按10 \ 10 2， 10 3, 10 4, 10 5, 10 6, 10 7, 10 8的倍数稀释，取最后几个梯度的菌液涂平板计数，重复3次，取 其平均值确定其真实的菌密度。同时每个梯度菌液各取3管提取RNA反转为cDNA后，以待 测样品cDNA为模板，用实施例3所述的干酪乳杆菌的种特异性引物及方法进行干酪乳杆菌 的目的基因片段的荧光定量PCR扩增（图3)，并以平板计数总菌数的对数值为横坐标，荧光 定量PCR反应的Ct值为纵坐标，得到菌数与Ct值的标准曲线（图4)。
[0104] 结果表明：Ct值为32时对应的总菌数即为干酪乳杆菌的检测下限，即为 8. 5X103cfu，亦即本发明提供的引物的荧光PCR检测的最低检测标准。
[0105] 实施例6 :
[0106] 在不含干酪乳杆菌的饲料中，添加终浓度为4. 63±0. 21X10scfu/g饲料的干酪乳 杆菌（平板计数菌数为4· 8X10scfu/g饲料、4· 4X10scfu/g饲料、4· 7X10scfu/g饲料）， 利用本发明的方法进行检测，得到的实时定量PCR检测Ct值为21. 66 ± 0. 26 (Ct值分别为 21. 47、21. 95、21. 55)，利用干酪乳杆菌标准品建立的标准曲线y= -3. 3252x+50. 537(R2 = 0. 9951)，得到饲料中是干酪乳杆菌的浓度为4. 89±0. 27X10scfu/g饲料（理论菌数分别 为 5· 5X10scfu/g饲料、4.OX10scfu/g饲料、5· 2X10scfu/g饲料），经SPSS17. 0 统计分 析，平板计数与本发明的方法得到两组数据差异不显著（P= 〇. 604)，即本发明的样品预处 理方法结合所选取目的基因，其检测结果具有准确性。
【主权项】
1. 用于饲料中添加的干酪乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒，包括引物：5'_ TGCGGCGGTAAAGGTTG-3\5, -CGTCTGTGTAGAAACTGCGAATG-3,〇2. 根据权利要求1所述的试剂盒，所述试剂盒的使用方法，包括饲料样品的预处理方 法，该方法包括： 经过充分粉碎混匀的饲料25g与225mL的灭菌生理盐水混合，在4°C以100转/分的 速度震荡1-2h，配成10%的均匀稀释液；对均匀稀释液进行10倍递增稀释，选择2个以上 的稀释度，根据需要，提取细菌基因组DNA或RNA。3. 权利要求1所述的试剂盒在干酪乳杆菌的快速定性中的应用。4. 权利要求1所述的试剂盒在干酪乳杆菌定量检测中的应用。5. 权利要求1所述的试剂盒在干酪乳杆菌的定性和定量检测中的应用。6. 权利要求1所述的试剂盒在制备干酪乳杆菌检测试剂中的应用。
【专利摘要】本发明公开了用于饲料中添加的干酪乳杆菌的快速定性、定量检测试剂盒及检测方法和应用，通过对已经报道的干酪乳杆菌基因组序列的比对分析，本发明提供了用于干酪乳杆菌定性定量检测的引物5’-TGCGGCGGTAAAGGTTG-3’、5’-？CGTCTGTGTAGAAACTGCGAATG-3’，同时本发明提供了一种饲料样品的预处理方法，使得饲料中的益生菌可以充分释放，准确真实的反应出饲料中的益生菌数目。本发明可以在不进行益生菌纯培养的基础上，简便、快速、准确地定性、定量检测猪饲料中干酪乳杆菌，检测程序简单、检测效率高、准确性好，灵敏度高，重复性好。
【IPC分类】C12R1/245, C12Q1/04, C12Q1/68
【公开号】CN105349670
【申请号】CN201510856158
【发明人】吴涛, 侯永清, 赵迪, 丁斌鹰, 易丹, 王蕾, 陈洪波
【申请人】武汉轻工大学
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年11月30日