1%的单糖，20%的人血清白蛋白，2.1%~2.3%的Rho抑制剂，继续在次声波条件下振荡30~45s，加入玻璃化液；
步骤三:将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降温速率迅速降温至_196°C ;
步骤四:存入液氮罐中保存24h。
[0036]步骤五:将冻存液从液氮中取出，投入LNG中升温lmin ;
步骤六:将冻存液从LNG中取出，在真空状态下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升温速率迅速降温至3.2-3.9°C ；
步骤七:将冻存液倒入0.9%的盐水中，维持温度在3.2-3.9°C的条件下，在次声波振荡条件下加入20%的人血清白蛋白，1%的单糖，0.23%的细胞生长因子，1.2%的非必需氨基酸，0.12%的L-谷氨酰胺，0.04%的β -巯基乙醇，调节体系的pH为6.8-7.6，加入1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，继续在次声波条件下振荡30~45s ;
步骤八:将稀释后的冻存液在400r/min的条件下离心5min，去除上清液，向细胞沉淀中加入0.21%~0.23%的细胞生长因子，重新悬浮细胞。
[0037]测定细胞的复苏率:将3X 105个复苏冻存干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:复苏率=培养后细胞总数+ (3X105X增值率)，得到冻存细胞的复苏率；同时将3 X 105个P2代干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:增值率=培养后细胞总数+ (3X 105)。
[0038]实验结果:测得复苏率为96.9%
实施例3
一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的复苏液，包括20%的人血清白蛋白，0.9%的单糖，0.22%的细胞生长因子，1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，1.1%的非必需氨基酸，0.1%的L-谷氨酰胺，0.032%的β -巯基乙醇，其余组分均为生理盐水。
[0039]实验冻存材料:动物，2岁龄比格犬，雄性，体重为22.7kg。
[0040]实验方法:
步骤一:抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%C02的培养箱中，37°C的温度下培养8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6X 104/cm2的细胞密度接种，培养至P2代。
[0041 ] 步骤二:将P2代骨髓间充质干细胞团完全浸泡在0.85%~0.9%的盐水中，维持温度在3.2-3.9°C的条件下，在次声波振荡条件下加入8.2%~8.6%的渗透性保护液，0.8%~1%的单糖，20%的人血清白蛋白，2.1%~2.3%的Rho抑制剂，继续在次声波条件下振荡30~45s，加入玻璃化液；
步骤三:将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降温速率迅速降温至_196°C ;
步骤四:存入液氮罐中保存24h。
[0042]步骤五:将冻存液从液氮中取出，投入LNG中升温lmin ;
步骤六:将冻存液从LNG中取出，在真空状态下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升温速率迅速降温至3.2-3.9°C ；
步骤七:将冻存液倒入0.9%的盐水中，维持温度在3.2-3.9°C的条件下，在次声波振荡条件下加入20%的人血清白蛋白，0.9%的单糖，0.22%的细胞生长因子，1.1%的非必需氨基酸，0.1%的L-谷氨酰胺，0.032%的β -巯基乙醇，，调节体系的pH为6.8-7.6，加入1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，继续在次声波条件下振荡30~45s ;
步骤八:将稀释后的冻存液在400r/min的条件下离心5min，去除上清液，向细胞沉淀中加入0.21%~0.23%的细胞生长因子，重新悬浮细胞。
[0043]测定细胞的复苏率:将3X 105个复苏冻存干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:复苏率=培养后细胞总数+ (3X105X增值率)，得到冻存细胞的复苏率；同时将3 X 105个P2代干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:增值率=培养后细胞总数+ (3X 105)。
[0044]实验结果:测得复苏率为97.6%
实施例4
一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的复苏液，包括20%的人血清白蛋白，0.3%的二羟基丙酮，0.5%的L-甘油醛，0.21%的细胞生长因子，1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，1.2%的非必需氨基酸，0.08%的L-谷氨酰胺，0.04%的β -巯基乙醇，0.68%的NaCl和75.49%的去离子水，其中细胞生长因子为表皮生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子1:1:1:1的混合溶液，表皮生长因子的浓度为5(^g/L，酸性成纤维细胞生长因子的浓度为15Pg/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为15Pg/L，血管内皮生长因子的浓度为4Pg/L。
[0045]实验冻存材料:动物，2岁龄比格犬，雄性，体重为22.7kg。
[0046]实验方法:
步骤一:抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%C02的培养箱中，37°C的温度下培养8d ;用0.25%的胰蛋白酶-0.02%的EDTA培养液进行第1次传代；以1.6X 104/cm2的细胞密度接种，培养至P2代。
[0047]步骤二:将P2代骨髓间充质干细胞团完全浸泡在0.85%~0.9%的盐水中，维持温度在3.2-3.9°C的条件下，在次声波振荡条件下加入8.2%~8.6%的渗透性保护液，0.8%~1%的单糖，20%的人血清白蛋白，2.1%~2.3%的Rho抑制剂，继续在次声波条件下振荡30~45s，加入玻璃化液；
步骤三:将步骤二中制得的混合液在真空状态下，直接投入液氮中，按照平均600°C /min的降温速率迅速降温至_196°C ;
步骤四:存入液氮罐中保存24h。
[0048]步骤五:将冻存液从液氮中取出，投入LNG中升温lmin ;
步骤六:将冻存液从LNG中取出，在真空状态下投入冰浴中，按照平均560°C /min的升温速率迅速降温至3.2-3.9°C ；
步骤七:将冻存液倒入0.9%的盐水中，维持温度在3.2-3.9°C的条件下，在次声波振荡条件下加入20%的人血清白蛋白，0.3%的二羟基丙酮，0.5%的L-甘油醛，0.21%的细胞生长因子，1.2%的非必需氨基酸，0.08%的L-谷氨酰胺，0.04%的β -巯基乙醇，0.68%的NaCl和75.49%的去离子水，其中细胞生长因子为表皮生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子1:1:1:1的混合溶液，表皮生长因子的浓度为5(^g/L，酸性成纤维细胞生长因子的浓度为15Pg/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为15Pg/L，血管内皮生长因子的浓度为4Pg/L，调节体系的pH为6.8-7.6，加入1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，继续在次声波条件下振荡30~45s ;
步骤八:将稀释后的冻存液在400r/min的条件下离心5min，去除上清液，向细胞沉淀中加入0.21%~0.23%的细胞生长因子，重新悬浮细胞。
[0049]测定细胞的复苏率:将3X 105个复苏冻存干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:复苏率=培养后细胞总数+ (3X105X增值率)，得到冻存细胞的复苏率；同时将3 X 105个P2代干细胞连续培养6天，用血球计数板计算出培养后的细胞总数，根据公式:增值率=培养后细胞总数+ (3X 105)。
[0050]实验结果:测得复苏率为97.3%
实施例5
一种用于玻璃化冻存骨髓间充质干细胞的复苏液，包括20%的人血清白蛋白，0.5%的二羟基丙酮，0.7%的L-甘油醛，0.23%的细胞生长因子，1.5%的羟乙基哌嗪乙硫磺酸，0.8%的非必需氨基酸，0.12%的L-谷氨酰胺，0.03%的β -巯基乙醇，0.69%的NaCl和75.63%的去离子水，细胞生长因子为表皮生长因子、酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子1:1:1:1的混合溶液，表皮生长因子的浓度为75Pg/L，酸性成纤维细胞生长因子的浓度为2(^g/L，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为2(^g/L，血管内皮生长因子的浓度为6Pg/L。
[0051]实验冻存材料:动物，2岁龄比格犬，雄性，体重为22.7kg。
[0052]实验方法:
步骤一:抽取骨髓，提纯分离出单个核细胞，将原代细胞接种培养48h后，在含有10mmol/L的地塞米松，2.16g/L的β -磷酸甘油钠和37.5mg/L的2-磷酸抗坏血酸的培养液中，5%C02的培养箱中，37°C的温