制剂用于每周两次给予。
[0136] 51.实施方案42-48中任一项的药物组合物，其中所述制剂用于每周一次给予。
[0137] 52.实施方案42-48中任一项的药物组合物，其中所述制剂用于每隔一周给予。
[0138] 53.实施方案42-48中任一项的药物组合物，其中所述制剂用于以每第20-25天 或例如每月一次的频率给予。
[0139] 54.用于治疗或预防骨损伤的方法，包括给予有需要的个体治疗有效量的C5aR 拮抗剂。
[0140] 55.用于延缓、停止或抑制骨损伤进展的方法，包括给予有需要的个体治疗有效 量的C5aR拮抗剂。
[0141] 56.用于增加骨密度的方法，包括给予有需要的个体治疗有效量的C5aR拮抗剂。
[0142] 57.实施方案54、55或56的方法，其中所述C5aR拮抗剂如实施方案16-42中任 一项所定义。
[0143] 58.实施方案57的方法，其中所述C5aR拮抗剂口服给予。
[0144] 59.实施方案57的方法，其中所述C5aR拮抗剂静脉内给予。
[0145] 60.实施方案57的方法，其中所述C5aR拮抗剂皮下给予。
[0146] 61.实施方案57-60中任一项的方法，其中所述C5aR拮抗剂一天一次给予。
[0147] 62.实施方案57-60中任一项的方法，其中所述C5aR拮抗剂一周两次给予。
[0148] 63.实施方案57-60中任一项的方法，其中所述C5aR拮抗剂一周一次给予。
[0149] 64.实施方案57-60中任一项的方法，其中所述C5aR拮抗剂以每第20-25天或例 如每月一次的频率给予。
[0150] 65.实施方案57-60中任一项的方法，其中所述有需要的个体是可受益于骨损伤 的治疗的个体，例如患有骨损伤或有发展骨损伤的风险的个体，其中骨损伤包括骨质侵蚀 和骨密度损失的一项或多项。
[0151] 66.实施方案57-65中任一项的方法，其中所述有需要的个体患有关节炎，例如 骨关节炎、类风湿性关节炎、脓毒性关节炎或银肩病性关节炎。
[0152] 67.实施方案57-66中任一项的方法，其中所述有需要的个体具有关节炎的一个 或多个症状，例如类风湿性关节炎的一个或多个症状。
[0153] 68.实施方案57-67中任一项的方法，其中给予实施方案42-54中任一项的药物 组合物。
[0154] 69.实施方案57-68中任一项的方法，其中所述方法用于获得快速反应。
[0155] 70.实施方案57-68中任一项的方法，其中所述方法用于治疗骨损伤或骨质侵 蚀，以在至多3个剂量后获得反应。
[0156] 71.实施方案57-68中任一项的方法，其中所述方法用于治疗骨损伤或骨质侵 蚀，其中在至多3个剂量后可检出快速反应。
[0157] 72.实施方案57-68中任一项的方法，其中所述方法用于治疗骨损伤或骨质侵 蚀，其中在至多3个剂量后在血清样品中可检出快速反应。
[0158] 73.实施方案57-68中任一项的方法，其中所述方法用于治疗骨损伤或骨质侵 蚀，其中在至多3个剂量后可检出一个或多个生物标志物的相关变化。
[0159] 74.实施方案57-68中任一项的方法，其中在至多3个剂量后可检出一个或多个 生物标志物的相关变化。
[0160] 75.实施方案57-68中任一项的方法，其中所述方法用于治疗骨损伤或骨质侵 蚀，其中可检出选自组织重塑或化学引诱物标志物的一个或多个生物标志物的相关变化。 实施例
[0161] 实施例1 20/70 (小鼠抗-mC5aR)和7F3 (小鼠抗-hC5aR)的结合区 测定和描述了 7F3和mAb 20/70分别与人和小鼠 C5aR的结合区（Lee等（2006) Nat Biotech 24 (10) 1279-1284)。简言之，嵌合人/小鼠 C5a受体使用重叠延伸PCR构建。合 成的寡核苷酸引物用于扩增人或小鼠 C5aR基因的区。连接需要的人和小鼠基因区段以形 成C5aR的完整编码序列加上来自牛视紫质的10个氨基酸的C-端标签。在组成型CMV启动 子的下游，将各DNA序列插入至哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1(+) (Invitrogen)中。按 照制造商的说明书，使用Lipofectamine 2000 (Invitrogen)将表达载体转染至小鼠 LL 2 细胞中。将大约1.6 Pg超螺旋质粒DNA加入至8 X IO5个细胞中。经转染的LI. 2细胞在 补充有10%胎牛血清（Hyclone)的RPMI 1640 (Gibco)中培养。
[0162] 转染后1天，将约6 X IO4个细胞以1，500 rpm离心5分钟，用PBS洗涤一次和重 悬于包含2% (wt/vol) BSA和0· 1% (wt/vol)叠氮化钠（染色缓冲液）和纯化的20/70抗 体（5 ug/ml)的100 ul PBS。在4°C 30分钟后，用染色缓冲液洗涤细胞两次和重悬于50 μι以1:200稀释于染色缓冲液的FITC-缀合的驴抗-大鼠 IgG (Jackson Laboratories)。 在4°C孵育20分钟后，用染色缓冲液洗涤细胞两次和在FACSCalibur (Becton-Dickinson) 上分析以测定表面表达水平。
[0163] 构建一系列包含小鼠和人C5aR的区段的嵌合受体以鉴定抗体20/70结合的C5a 受体的区。各受体构建体包含0、1、2、3或全部4个小鼠 C5aR胞外结构域，其中缺失的结构 域为人C5aR序列。在各构建体中的4个胞外结构域（N-端，第1、2和3个胞外环）的起点 示意性地示于图1中，以及FACS数据的概述中。
[0164] 图1表明抗_C5aR mAb 20/70结合小鼠 C5aR的第2个胞外环和7F3结合人C5aR 的相应的第2个环。20/70结合构建体4、5、7、9和10,其全部都含有小鼠 C5aR第2个胞外 环。事实上，构建体#7包含全部人C5aR，除了第2个环为小鼠 C5aR。此外，20/70不与人 C5aR交叉反应，如通过缺少与构建体#1的结合所证实。在仅FITC-缀合的二次抗体的存在 下（即无一次抗体）孵育的转染子显示无染色（数据未显示）。
[0165] 实施例2 C5aR诘抗剂的体外试验 ⑶Ilb受体上调 抗-C5aR mAb (m20/70)抑制响应C5a的CDllb表达上调的能力 测定法设置 设计以下设置，通过测量CDllb表达的变化以测定C5aR拮抗剂中和C5a-诱导的嗜中 性粒细胞成熟的能力。
[0166] 材料和方法： 通过穿刺颂下丛，从首次用于实验的C57BL/6小鼠（Taconic, Denmark)采集血液 至EDTA-涂覆的管中。采集后，合并血液，将10 μL的不同浓度的抗-C5aR mAb (m20/70， Shushakova等2002，Hycult biotech)(见表）加入至11个等份的90 μL合并血液中，并在 室温（RT)下孵育20分钟。孵育后，加入9 μL含10 Pg/ml重组小鼠 C5a (Hycult Biotech, HC1101)的 PBS/0. 1% BSA (Miltenyi Biotech, 130-091-376)至除了管 1 的各管，在 RT 下 孵育 20 分钟。然后使用 50 μL 在包含 Cellwash (BD Biosciences, 349524)和 0· 2% BSA (Miltenyi Biotech, 130-091-376)的染色缓冲液中的包含饱和浓度的抗-Ly6G-PE (BD Biosciences, 55161)和抗-CDllb-AF700 (eBiosciences, 56-0112-82)的混合母液，将 各样品染色用于流式细胞术。对于死细胞的染色，根据制造商的说明书将Fixable Near IR 死细胞染色试剂盒（Invitrogen，L10119)加入至染色混合物。在4°C孵育20分钟后，通过 加入FACS裂解溶液（BD Biosciences, 349202)和在暗室中在RT下孵育15分钟，将红细 胞裂解。使用染色缓冲液洗涤细胞两次，随后在LSRII流式细胞仪（BD Biosciences)上使 用FACS Diva软件分析。
[0167] 结果： 将在嗜中性粒细胞（定义为活Ly6G+细胞）上C5a-诱导的CDllb表达定量为从来自未 加入C5a的血液得到的值中减去给定抗-C5aR mAb浓度的AF700的平均荧光强度（FI)(图 2)。在GraphPad Prism软件（v. 5. 03)中使用非线性曲线拟合，将抗-C5aR mAb的IC50 值计算为〇· 6 Pg/ml。
[0168] 接着可修改测定法以测试其他化合物，以评价它们作为C5aR拮抗剂的相关性。
[0169] CD62L￥ 体下调 测定法设置 设计以下设置，通过测量CD62L表达的变化，来测定C5aR拮抗剂中和C5a-诱导的嗜中 性粒细胞活化的能力。
[0170] 上述⑶77祝则定法经修改，通过使用识别⑶62L的缀合抗体（BD Biosciences,目 录号559772)用于⑶62L检测。特别用于⑶62L的实验详情见下文。
[0171] FACS和数据分析 用对通道FL-4建立的补偿参数设置FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences)。门 控样品以排除死细胞和碎片。嗜中性粒细胞鉴定为具有高FSC和SSC，并门控。计算在FL-4 (⑶62L-APC)通道中的经门控的嗜中性粒细胞的平均荧光强度（MFI)。
[0172] 结果表示为减去背景的最大⑶62L表达的百分比。最大⑶62L表达（Max⑶62L) 是没有C5a和没有C5aR拮抗剂下孵育的嗜中性粒细胞的平均MFI。最小（背景）CD62L表 达（MinCD62L)是具有C5a但没有C5aR拮抗剂下孵育的嗜中性粒细胞的平均MFI。对各样 品，用于计算最大⑶62L表达的％的公式是：
可将数据输入GraphPad Prism (v4. 0)和拟合至S形剂量-反应曲线（可变斜率），即 使用非线性回归的4-参数对数方程以计算EC50。
[0173] 置换测定法 可应用闪烁迫近分析法（SPA)以测定C5aR拮抗剂置换与C5aR结合的C5a的效力。SPA 的详细描述提供在美国专利4568649和由制造商（Amersham Biosciences)提供的方案中。 简言之，自RBL-hC5aR细胞纯化的携带受体的膜片段结合至包被有麦胚凝集素（WGA)的闪 烁微粒。在加入放射性标记的hC5a (125I)示踪剂之后，与受体的结合将导致光从颗粒发 射。SPA-原理的特别之处在于，仅彼此直接靠近的放射性同位素和颗粒将发射光。即，仅 与受体结合的放射性标记的hC5a与WGA-颗粒足够靠近才产生光。因此，发射的光的量表 示受体-结合的 125I_hC5a的量。测定法是竞争测定法，其中抗_hC5aR/未标记的hC5a与 示踪剂竞争与受体的结合。在该测定法中，将固定量的 125I-标记的C5a加入至WGA-颗粒 和C5aR受体，导致一定量的光的发射，测量为计数/分钟（cpm)。如果加入未标记的C5a或 抗-C5aR，则其与受体的结合将引起较低的cpm，这是由于置换 125I C5a所致。％置换如下计 算：
S:样品 s_:非特异性结合，通过加入足以代替特异性结合125I-hC5a的量的未标记的hC5a测 量 S。:最大结合。未加入未标记的hC5a。
[0174] IC50值定义为置换50%的C5a的浓度。在实验之间cpm保持恒定，因此IC50值是 相对的，因为示踪剂随时间衰减（decade)。化合物置换 125I_hC5a的效力（IC50)可用于鉴 定C5aR拮抗剂。
[0175] 嗜中性粒细胞迀移（趋化性）测定法 C5aR拮抗剂抑制hC5a (或mC5a)依赖性嗜中性粒细胞迀移的效力可在Boyden室中 分析。将自人或动物血液分离的嗜中性粒细胞用钙黄绿素染色，加入至Boyden室的上层小 室，并与抗体混合。将hC5a或mC5a施加于Boyden室的下层小室，其起嗜中性粒细胞的化 学引诱物的作用。嗜中性粒细胞迀移至下室的能力通过计算穿过3或5μηι fluoroblok膜 的钙黄绿素染色的嗜中性粒细胞的数量来确定。
[0176] 人PMN (多形核白细胞；粒细胞）获自抽取到含有EDTA的小管中的人血液样品。 血细胞通过在室温下通过Ficoll-Paque PLUS (GE Health Care)梯度（3份）离心血液 (4份）30分钟（400 X g)分离。将含PMN层悬浮于含葡聚糖-500 (Sigma)的PBS (磷 酸缓冲盐水）I h，以除去污染的红细胞。将上清液在室温下离心5分钟（250 X g)，使用 0. 2% NaCl渗透溶解剩余的红细胞55 s。利用1. 2 % NaCl + PBS使溶液等渗，以250 X g 离心5分钟，然后重复渗透溶解。离心后，将PMN重悬于反应混合物（RM) : HBSS (目录号 14175 Gibco)包含 NaCl 137mM、KCl 5. 3mM、Na2HPO4 0· 33mM、NaHCO3 4mM、KH2PO4 0· 44mM、 葡萄糖 5mM;补充有 MgSO4WH2O 0.4mM、MgCl2 0.5mM、CaCl2 0.5mM、HEPES 20mM。通过 NucleoCounter (Chemometec)测定细胞密度。PMN悬液应包含>95 %嗜中性粒细胞，如通 过吉姆萨染色的样品的显微镜检查所估计。
[0177] 负载PMN :将钙黄绿素，AM, (Fluka)溶于DMSO (二甲基