针对cxcr5的单克隆抗体的制作方法

针对cxcr5的单克隆抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及特异性针对CXCR5的抗体。更具体地，本发明涉及单克隆抗体，且更具 体地是全人单克隆抗体，其以高亲和力特异性结合并中和人CXCR5。本发明还涉及编码所述 抗体的核酸、用于表达这些核酸的载体，以及用于生产所述抗体的宿主细胞。此外，本发明 涉及所述抗体在诊断和/或治疗自身免疫疾病或炎性疾病以及癌症中的应用。
【背景技术】
[0002] 初始B细胞啮合其B细胞受体（BCR)上的抗原（Ag)，上调CCR7并迀移至外部T细 胞区以引发T细胞辅助，导致以T细胞依赖或不依赖方式进行分化。T细胞依赖型B细胞 激活导致分泌浆细胞的短期IgM抗体。然而，与激活的T细胞的关联相互作用可进一步扩 大B细胞功能并驱动滤泡分化。通过T细胞区运输的聚集的辅助T细胞暴露于抗原呈递细 胞（APC)(如树突细胞）上MHC II型（MHCII)复合体上的相同抗原。抗原-MHCII复合体 的呈递可导致具有相关抗原受体的T细胞的激活和增殖。激活的T细胞迀移至B细胞区域 并以相同特异性啮合B细胞上MHCII结合的Ag，导致形成免疫突触。以该方式激活的B细 胞催化滤泡生成并经历强烈增殖，分化为高亲和力记忆B细胞或长期浆细胞。通过BCR的 体细胞高度突变生成高亲和力抗原结合B细胞的标准受到专门的间充质和T细胞群体的控 制。通过与滤泡B辅助T细胞（TFH)相互作用来选择能够啮合并加工滤泡树突细胞（FDC) 呈递的抗原的高亲和力抗原结合B细胞以进行进一步分化。与??Η细胞的相互作用促进选 择高亲和力接头，以及用于分化为浆细胞和长期浆细胞的信号转导。B和??Η细胞上CXCR5 的表达已知在优化生发中心内的这些相互作用中起关键作用。促进这些T和B细胞相互作 用的特化微环境由组成型表达CXCL13的FDC产生，其促进表达CXCR5的特化的淋巴细胞子 集的定位和停留。
[0003] 在生发中心中，需要与CXCR5阳性??Η细胞相互作用以诱导高亲和力抗体应答。文 献中越来越多的证据表明，B细胞在多发性硬化（MS)的发病中起作用，其生成导致髓磷脂 破坏的特异性（自身）抗体。此外，B细胞涉及MS疾病过程的全部阶段，从起始（抗原捕 获）至炎症和组织损伤并可在MS中起其他作用，包括但不限于抗原呈递和细胞因子产生。 在现有的MS疗法中，直到最近之前都未直接靶向B细胞，其中试验性研究使用单克隆抗体 (mAb)利妥昔单抗（抗CD20)。然而，随着许多当前MS疗法（干扰素 β、糖皮质激素、米托 蒽醌、那他珠单抗、芬戈莫德）和即将使用的MS疗法（阿来组单抗）具有影响B细胞行为 的潜力，对B细胞的作用可能有助于其治疗效力。
[0004] CXCR5(也称为伯基特淋巴瘤受体，即BLR-I，和⑶185)是一种G蛋白偶联的七次 跨膜结构域受体（GPCR 7TM受体），其在B细胞和⑶4 T细胞亚群上高度表达。唯一已知的 CXCR5配体是CXC趋化因子CXCL13 (也称为BLC或BCA-1)。CXCR5的靶向删除显示该受体 涉及B细胞迀移和淋巴结内的B细胞定位。在缺失CXCR5的情况下，B细胞无法从富T细 胞区迀移至脾的B细胞滤泡，且结果是未形成功能性生发中心。CXCL13和CXCR5敲除小鼠 具有类似表型，但有趣的是，其仍能够生成显著的抗原特异性应答，但比野生型小鼠中低得 多。
[0005] CXCL13高度表达于发炎的中枢神经系统（CNS)，但在正常CNS中实际上不可检测。 CXCL13的鞘内产生被认为负责将CXCR5阳性B和T细胞招募至脑脊液（CSF)，且MS患者的 CSF中大部分B细胞是CXCR5阳性的。还在继发进展型MS患者脑膜的淋巴滤泡样结构中 观察到的FDC中检测到CXCL13表达。MS中发现的致病性B细胞应答是经证明调节B细胞 功能的异位淋巴结构中淋巴细胞累积的直接产物。此外，非常靠近主动脱髓鞘损伤生成导 致持久性自身免疫应答的自身抗原，从而在驱动疾病慢性化过程中起主要作用。CXCL13和 B细胞激活因子（BAFF ;B细胞存活的关键调控因子）都在小鼠的CNS中显著且恒定地上调 并复发缓解或慢性复发实验性自身免疫脑脊髓炎（EAE)，表明在动物模型中，B细胞功能也 在CNS炎症的慢性化过程中起作用。该发现与CXCL13敲除小鼠的表型一致，其显示与野生 型对照相比较轻形式的EAE并具有炎性症状的快速消散和从疾病中完全恢复。这些研究证 明，CXCL13和CXCR5在B细胞迀移、分化和增殖应答中起重要作用。血管系统中存在的B细 胞数量相对较低，因此特化的淋巴微环境内的定位对于与决定B细胞效应功能的其他淋巴 细胞子集的相互作用而言至关重要。CXCR5的表达在该过程中起核心作用，因此CXCR5拮 抗可潜在地通过降低招募至CNS的B和T细胞来阻断MS疾病，具体方法为通过抑制B细胞 成熟为浆细胞或中心细胞和通过阻断与IFH细胞的相互作用和自身抗体产生。可能显著的 是，CXCR5阻滞可通过减弱这些无菌淋巴环境内的自体抗原呈递来破坏异位淋巴滤泡发育， 并促进炎性过程的缓解。
[0006] 还在其他慢性炎性疾病（如类风湿性关节炎（RA)和舍格伦综合征）中通过 CXCL13表达和与携带CXCR5的细胞相互作用鉴定到了异位淋巴结构的生成，且最近已证明 CXCR5表达存在于多种胰腺癌中。因此，通过使用针对CXCR5的抗体，CXCR5的拮抗可以是这 些疾病中有用的治疗方法。鉴于上文所述患有EAE的小鼠的CNS中BAFF和CXCL13 (CXCR5 的配体）表达的相似性，这是可信的，且原因是抗BAFF疗法是对炎性/自身免疫疾病治疗 而言是广泛接受的。实际上，不同的抗BAFF抗体已上市或正在开发用于治疗炎性/自身免 疫疾病：例如，已被批准用于系统性红斑狼疮（SLE)的贝利木单抗也被评估针对诸如MS、RA 和舍格伦综合征的疾病，且塔巴单抗（tabalumab)目前正在SLE和MS的临床试验中。
[0007] 如上文所述，CXCL13/CXCR5通路在B细胞功能中起关键作用。Burkle等（2007) 还证明，该通路参与癌症，如B细胞慢性淋巴细胞性白血病（B-CLL)。其特别证明，CLL患者 的血清CXCL13水平显著高于健康患者。作者还证明，抗CXCR5抗体抑制对CXCL13的趋化 性，表明CXCR5是针对CLL患者的新治疗靶标。
[0008] W02009032661描述了特异性结合人CXCR5的胞外结构域的人源化抗体多肽。其还 描述了治疗涉及CXCR5阳性细胞疾病患者的方法，包括给予所述患者结合CXCR5的CXCR5 拮抗剂。
[0009] 考虑到炎性和/或自身免疫疾病以及癌症对于公共健康的重要影响，因此还需要 可特别用作治疗炎性和/或自身免疫疾病（如多发性硬化、类风湿性关节炎或舍格伦综合 征）以及癌症（如胰腺癌、B-CLL或涉及CXCR5/CXCL13通路的癌症/淋巴瘤）的药物的新 分子。

【发明内容】

[0010] 本发明提供了特异性结合CXCR5的新单克隆抗体，特别是全人抗体。这些CXCR5 抗体不仅能够结合还能够中和CXCR5。因此，其特别能够结合CXCR5 +细胞，如B细胞。
[0011] 在第一实施方式中，本发明描述了经由其互补决定区（⑶R)序列结合CXCR5的抗 体或其部分。包含所述CDR的抗体保留了这些CDR来源的母体分子的CXCR5结合特异性。
[0012] 在另一个实施方式中，描述了所述抗体的构架区（FR)。所述FR将与本发明所述 CDR组合。
[0013] 在另一个实施方式中，还公开了感兴趣的抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序 列，以及可与其组合的优选的恒定区的氨基酸序列。
[0014] 本发明的另一个实施方式由编码本发明抗体的多核苷酸序列、载体和包含所述多 核苷酸序列的细胞系组成。
[0015] 还描述了 一种生成本发明所述抗体的方法。
[0016] 本发明的另一个实施方式是一种药物组合物，其包含一种或至少一种感兴趣的抗 体。
[0017] 在最后的实施方式中，本发明所述单克隆抗体用作药物。具体而言，其可用于治疗 与CXCR5或CXCR5通路相关的疾病，并可用于治疗自身免疫或炎性疾病。具体而言，这类疾 病或病症选自多发性硬化、类风湿性关节炎或舍格伦综合征。其还可用于治疗癌症，如胰腺 癌、B-CLL或涉及CXCR5/CXCL13通路的其他类型的癌症。
[0018] 定义
[0019] -术语"免疫球蛋白"（Ig)指由一种或多种多肽组成的蛋白，所述一种或多种多肽 基本由免疫球蛋白基因编码。一种免疫球蛋白形式构成了抗体的基本结构单元。该形式是 四聚体且由两个相同的免疫球蛋白链的对组成，各对具有一条轻链和一条重链。轻链具有 两部分：可变结构域（VL)和恒定结构域（CL)，其在轻链的上下文中也称为恒定区。重链也 具有两部分：可变结构域（VH)和恒定区（CH)。在各对中，轻链和重链可变结构域共同主要 负责结合抗原，且恒定区负责抗体效应功能。全长免疫球蛋白"轻链"（通常约25kDa)由 N末端处的可变结构域基因（通常约110个氨基酸）和C末端处的κ或λ恒定区结构域 (分别为CjP C λ)编码。全长免疫球蛋白"重链"（通常约50kDa)类似地由可变结构域基 因（通常约116个氨基酸）和后文所述其他恒定区基因之一（通常约330个氨基酸）编码。 存在五种类型的哺乳动物重链，其由希腊字母命名：[α ]、[ δ ]、[ ε ]、[ γ ]和[μ ]。重链 类型分别将抗体的同种型限定为IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。恒定区在相同同种型的所有抗 体中都相同，但在不同同种型的抗体中不同。重链[Υ]、[α]和[δ]的恒定区由三个Ig 恒定结构域（CH1、CH2和CH3)和一个铰链区（用于增加挠性）组成；重链[ε ]和[μ ]的 恒定区由四个Ig恒定结构域（CH1、CH2、CH3和CH4)和一个铰链区组成。
[0020] 免疫球蛋白轻链或重链可变结构域由"构架"区组成，其被三个高变区打断。因 此，术语"高变区"指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自"互补决定区"或 "⑶R"的氨基酸残基，即轻链可变结构域中的L-⑶RUL-⑶R2和L-⑶R3和重链可变结构域 中的H-CDRl、H-CDR2和H-CDR3 (Kabat等1991)和/或来自"高变环"的那些残基（Chothia 和Lesk，1987)。"构架区"或"FR"残基是除了本文所限定的超变区残基之外的那些可变 区残基。不同轻链的构架区（即L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4)或不同重链的构架区（即 H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4)的序列在物种内是相对保守的。因此，"人构架区"是与天然 产生的人免疫球蛋白的构架区基本相同（约85%或更高，通常约90-95%或更高）的构架 区。抗体的构架区即组成轻链和重链的组合的构架区，其用作定位和对齐CDR。CDR主要负 责与抗原表位的结合。
[0021] -本文所用术语"抗体"及其复数形式包括但不限于多克隆抗体、亲和纯化的多克 隆抗体、单克隆抗体和抗原结合片段，如F(ab'）2、Fab蛋白酶水解片段以及单链可变区片 段（scFv)。还包括遗传工程改造的完整抗体或片段，例如嵌合抗体、scFv和Fab片段，以及 合成的抗原结合肽和多肽。
[0022] -术语"人源化"免疫球蛋白指包含人构架区和一个或多个来自非人（通常是小鼠 或大鼠）免疫球蛋白的CDR的免疫球蛋白。提供CDR的非人免疫球蛋白称为"供体"且提 供构架区的人免疫球蛋白称为"受体"（通过将非人CDR接枝在人构架和恒定区上，或通过 将整个非人可变结构域整合在人恒定区上（嵌合化）来进行人源化）。恒定区无需存在，但 如果存在，其必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90%，优选约95%或更高 相同。因此，人源化免疫球蛋白的所有部分都与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基本相 同，如果需要调节效应功能则重链恒定区中的一些残基和CDR除外。"人源化抗体"是包含 人源化轻链可变结构域和人源化重链可变结构域的抗体。在一些情况下，人源化抗体可保 留人构架区内的非人残基以增强适当的结合特征和/或可将一些氨基酸突变导入CDR内以 改进结合亲和力和/或降低免疫原性和/或提高人的程度和/或改进抗体的生物化学/生 物物理学性质。通过人源化抗体，可提高生物半衰期，并降低了给予人后不良免疫反应的潜 力。
[0023] -术语"全人"免疫球蛋白指包含人构架区和人CDR的免疫球蛋白。恒定区无需存 在，但如果存在，其必须与人免疫球蛋白恒定区基本相同，即至少约85-90%，优选约95% 或更高相同。因此，全人免疫球蛋白的所有部分都与天然人免疫球蛋白序列的相应部分基 本相同，如果需要调节效应功能或药代动力学特征则重链恒定区中的一些残基除外。"全人 抗体"或"全人单克隆抗体"是包含全人轻链可变结构域和全人重链可变结构域的抗体。在 一些情况下，可将氨基酸突变导入CDR、构架区或恒定区内以改进结合亲和力和/或降低免 疫原性和/或改进抗体的生物化学/生物物理学性质。
[0024] 术语"重组抗体"指其中氨基酸序列不同于天然抗体的抗体。由于抗体生成中重 组DNA技术的相关性，无需限制于天然抗体中发现的氨基酸的序列；可以重新设计抗体以 获得所需的特性。可能的变化形式有很多且范围为从改变仅一个或一些氨基酸到完全重新 设计例如可变结构域或恒定区。通常进行恒定区中的变化以改进、降低或改变诸如补体固 定（例如补体依赖的细胞毒性，CDC)、与Fc受体相互作用，以及其他效应功能（例如抗体依 赖的细胞毒性，ADCC)、药代动力学特性（例如与新生儿Fc受体结合；FcRn)。将进行可变结 构域中的变化以改进抗原结合特性。除抗体外，免疫球蛋白还可以多种其他形式存在，包括 例如单链或Fv、Fab和（Fab'）2以及双抗体、线性抗体、多价或多特异性杂交抗体。
[0025] -本文所用术语"抗体部分"指完整或全长链或抗体的片段，通常是结合或可变区。 所述部分或片段应维持完整链/抗体的至少一种活性，即其是"功能性部分"或"功能性片 段"。如果其维持至少一种活性，其优选维持靶标结合特性。抗体部分（或抗体片段）的示 例包括但不限于"单链Fv"、"单链抗体"、"Fv"或"scFv"。这些术语指包含重链和轻链可变 结构域但缺少恒定区的抗体片段，所有片段都在单个多肽链中。通常，单链抗体还包含VH 和VL结构域之间的多肽接头，其促使形成允许抗原结合的所需结构。在具体的实施方式 中，单链抗体还可以是双特异性和/或人源化的。
[0026] _"Fab片段"由一条轻链和一条重链的可变结构域和CHl结构域组成。Fab分子的 重链无法与另一重链分子形成二硫键。含有一条轻链和一条重链且含有较多的恒定区（在 CHl和CH2结构域之间）从而在两条重链之间形成链间二硫键的"Fab'片段"称作F (ab'）2 分子。"F (ab'）2"含有两条轻链和两条重链，其含有CHl和CH2结构域之间的一部分恒定 区，使得两条重链之间形成链间二硫键。在定义了一些重要术语后，现在可以关注于本发明 的特定实施方式。
[0027] -在本发明的上下文中，术语"治疗"指对于疾病进展的任何有利影响，包括在疾病 开始后减弱、减少和降低或缓解疾病发展。
[0028] -术语"药学上可接受的"旨在涵盖任何运载体，其不干扰活性成分的生物学活性 的有效性并且对给予的宿主无毒。例如，对于胃肠道外给药，活性蛋白质可配制为用于在载 剂中注射的单位剂型，载剂例如但不限于盐水、右旋糖溶液、血清白蛋白和林格氏溶液。
[0029] -人免疫系统已进化为对抗各种病毒、微生物和其他威胁。体液组分一抗体应答一 是免疫系统武器库的关键组分。抗体可包被、阻断和加工外来侵入物，且重要的是招募免疫 效应细胞以使用多种防御措施来应对侵入物。人免疫系统中存在多种抗体类型和同种型， 各自被赋予多种效应功能，其可调节为针对侵入病原体的性质。重组治疗性抗体构建自人 序列且几乎总是衍生自IgG类。迄今为止，大多数治疗性抗体衍生自IgGl同种型，其次是 IgG2和IgG4。IgGl同种型具有广泛应用性的原因是其啮合免疫效应细胞和补体的嵌入能 力（built-in ability)。抗体或效应细胞介导的效应功能主要包括细胞裂解（ADCC=抗体 依赖性细胞介导的细胞毒性）、吞噬作用（ADCP =抗体依赖性细胞介导的吞噬作用）和补 体依赖性细胞毒性（CDC)。我们对于这些效应功能的认识大部分来自对抗体介导的杀伤的 体外分析。例如，人PBMC (外周血单核细胞）与靶细胞（通常是肿瘤细胞系）和靶标特异 性抗体