的孵育导致靶细胞在数小时的时间内裂解。大多数（如果不是全部）ADCC由自然杀 伤（NK)细胞进行。已确定，经典IgG效应功能由适当命名的Fcy受体介导（Nimmerjahn 和1^^^(*，2011)。在人中，？。丫1^包括三种激活受体，？〇丫1?1、？〇丫1?113和？〇丫1?1113， 且这些受体在白细胞上以不同水平和专一性表达。通过ITAM胞内结构域的所有信号导 致信号级联反应，导致各表达Fc γ R的细胞的同源效应功能。NK细胞几乎排他性地表达 Fc γ Rllla，且该受体确定负责介导体外ADCC。抗体Fc与补体蛋白Clq啮合触发的经典（抗 体依赖性）补体通路包括非细胞和细胞机制，以及补体和Fc γ R通路之间的协同性。
[0030] 发明详述
[0031] 本发明基于新单克隆抗体的发现，更具体地是特异性针对CXCR5的全人单克隆抗 体。具体而言，其特异性针对CXCR5的人和猕猴（例如食蟹猴）形式，即其是交叉反应性的。 作为CXCR5的拮抗剂，这些抗体可用于治疗炎性和/或自身免疫疾病或病症，例如多发性硬 化（MS)、类风湿性关节炎（RA)或舍格伦综合征。其还可用于治疗癌症，如胰腺癌、B-CLL或 涉及CXCR5/CXCL13通路的其他类型的癌症。
[0032] 本发明提供了识别、结合、调节和/或中和CXCR5(优选CXCR5的人和猕猴（例 如食蟹猴）形式）的单克隆抗体的应用。具体而言，本发明提供了结合、调节和/或中和 CXCR5(优选CXCR5的人和猕猴（例如食蟹猴）形式）的轻链和重链可变结构域的应用。此 外，本发明所述单克隆抗体抑制通过CXCR5的CXCL13信号传导。已证明（参见实施例部 分），其能够抑制CXCL13诱导的胞内钙流，抑制CXCL13诱导的趋化性和CXCL13诱导的ERK 磷酸化。其还能够介导针对原代人B细胞的ADCC。本发明所述抗体优选消耗抗体，即优势 在于其能够消除自体同源的T和B细胞以及相关树突细胞和巨噬细胞。其轻链和重链可变 结构域可分别融合至κ或λ恒定结构域和选自任意同种型（IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)的 重链的恒定区，并可在多种宿主细胞中表达。优选地，选择的恒定区是IgG的恒定区，且更 优选地是lgGl、IgG2或IgG4的恒定区，且更优选地是IgGl的恒定区。本发明所述抗体或 其部分可以是糖基化/非糖基化和/或岩藻糖基化/非岩藻糖基化的。优选的本发明所述 抗体的岩藻糖含量较低或是非岩藻糖基化的，允许增强的ADCC。
[0033] 根据第一实施方式，结合CXCR5的本发明所述单克隆抗体中任一种或其片段的重 链可变结构域包含H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3且其轻链可变结构域包含L-CDR1、L-CDR2和 L-CDR3。优选地，1)重链可变结构域包含H-CDRUH-CDR2和H-CDR3,其中H-CDRl由选自SEQ ID N0:8和9的氨基酸序列组成；H-⑶R2由选自SEQ ID NO: 10和11的氨基酸序列组成；且 H-CDR3由选自SEQIDN0:12和13的氨基酸序列组成；且2)轻链可变结构域包含L-CDR1、 L-CDR2和L-CDR3,其中L-CDRl由选自SEQ ID NO: 14和15的氨基酸序列组成；L-CDR2由选 自SEQ ID NO: 16和17的氨基酸序列组成；且L-CDR3由选自SEQ ID NO: 18和19的氨基酸 序列组成。更优选地，本发明所述单克隆抗体具有其H-⑶RU H-⑶R2和H-⑶R3组，包含或 分别由以下序列组成：1)氨基酸序列SEQ ID NO: 8、10和12, 2)氨基酸序列SEQ ID NO: 8、 11和12 ;或3)氨基酸序列SEQ ID N0:9、11和13。类似地，这些单克隆抗体优选具有其 L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3组，包含或分别由以下序列组成：1)氨基酸序列SEQ ID NO: 14、 16 和 18, 2)氨基酸学 SEQ ID NO: 15、17 和 18 ;或 3)氨基酸序列 SEQ ID NO: 15、17 和 19。
[0034] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种单克隆抗体或其部分，如本文所述，其 中：1)这些单克隆抗体的重链可变结构域包含构架区（FR)H-FRU H-FR2、H-FR3和H-FR4， 其中：H-FRl由SEQ ID NO:20的氨基酸序列组成，H-FR2由选自SEQ ID NO:21和22的氨基 酸序列组成，H-FR3由选自SEQ ID NO: 23和24的氨基酸序列组成，且H-FR4由选自SEQ ID NO: 25和26的氨基酸序列组成；且2)轻链可变结构域包含L-FR1、L-FR2、L-FR3和L-FR4,其 中：L-FRl由选自SEQ ID NO:26、27和28的氨基酸序列组成，L-FR2由选自SEQ ID NO:29、 30和31的氨基酸序列组成，L-FR3由选自SEQ ID NO: 32和33的氨基酸序列组成，且L-FR4 由SEQ ID NO:34的氨基酸序列组成。优选地，本发明所述单克隆抗体的重链可变结构域组 H-FR1、H-FR2、H-FR3和H-FR4包含或分别由以下序列组成：1)氨基酸序列SEQ ID N0:20、 21、23和25,或2)氨基酸序列SEQ ID NO: 20、22、24和25,且其轻链可变结构域组L-FRl、 L-FR2、L-FR3和L-FR4包含或分别由以下序列组成：1)氨基酸序列SEQ ID N0:26、29、32和 34，或2)氨基酸序列SEQIDN0:27、30、33和34，或3)氨基酸序列SEQIDN0:28、31、33和 34。优选地，本发明所述H-FR和L-FR与上文所述H-⑶R和L-⑶R相关。
[0035] 在另一个实施方式中，本发明提供了一种单克隆抗体或其部分，优选全人单克隆 抗体，其中重链可变结构域包含或由选自SEQ ID勵:1、3、4、51、53、55、57、59和61的氨基 酸序列组成；轻链可变结构域包含或由选自SEQ ID勵:2、5、6、7、52、54、56、58、60、62和65 的氨基酸序列组成。在优选的实施方式中，本发明提供了一种单克隆抗体，其中，该重链可 变结构域包含或由选自SEQ ID NO: 1、3和4的氨基酸序列组成；且该轻链可变结构域包含 或由选自SEQ ID N0:2、5、6和7的氨基酸序列组成。优选地，重链可变区和轻链可变区的组 合选自 1)SEQ ID N0:1 和2(mAb称作40C01)，2)SEQ ID N0:3和7(mAb称作40C01-VH1-Vk3)， 以及3)SEQIDN0:4和7(mAb称作40C01-VH2-Vk3)。与母体mAb40C01(SEQIDN0 1和 2)相比，使用具有SEQ ID N0:3或4的氨基酸序列的重链可变区以及具有SEQ ID N0:5、6 或7的氨基酸序列的轻链可变区获得的Fab的热稳定性显著提高。使用40C01-VH1-Vk3和 40C01-VH2-Vk3获得了最佳结果。在替代性实施方式中，重链可变区和轻链可变区的组合 还可选自：1)SEQ ID N0:51 和 52(mAb 称作优化的 42R)3)、2)SEQ ID N0:53 和 54(mAb 称作 80A10)、3)SEQIDN0:55和56(mAb称作80All)、4)SEQIDN0:57和58(mAb称作80B09)、 5)SEQ ID N0:59 和 60(mAb 称作 80D11)、5)SEQ ID N0:61 和 62(mAb 称作 42R)3)，以及 6) SEQ ID NO: I 和 65 (mAb 称作 12A01)。
[0036] 还提供了其他重链可变区，其氨基酸序列与本发明所述重链可变区的序列至少 90 %或以上相同，至少95 %或以上相同，或者至少99 %或以上相同。还提供了其他轻链可 变区，其氨基酸序列与本发明所述轻链可变区的序列至少90%或以上相同，至少95%或以 上相同，或者至少99 %或以上相同。
[0037] 本发明所述工程改造的单克隆抗体（优选全人抗体）可包含任何类型的重链恒 定区或其部分，其来自任何类的抗体（包括IgM、IgG、IgD、IgA和IgE)和任何亚类（同种 型）（特别包括IgGU IgG2、IgG3和IgG4)。在需要抗体表现出细胞毒性活性时，重链恒定 结构域通常是补体固定恒定结构域且类型通常是IgGl类。不需要这种细胞毒活性时，恒定 区可以是IgG2或IgG4类。工程改造的抗体可含有来自一种以上类型或同种型的序列。在 本发明中，可以使用IgG的IgGU IgG2或IgG4类。例如，可以使用以下重链恒定区序列： 1)在CHl结构域的214位具有精氨酸且在356和358位分别具有谷氨酸和甲硫氨酸的同 种异型Glm (f)的IgGl，如Kabat等提出的人IgG的EU指数所示（Press和Hogg, Biochem J. 1970)并公开于SEQ ID NO: 38, 2)具有SEQ ID NO: 39所公开序列的IgG2同种型（亚型 HC2h，参见W02009010290)，或者3)Angal等，1993所述IgG4同种型，其中Kabat等提出的 人IgG4的EU指数所示228位的丝氨酸和409位的精氨酸分别被脯氨酸和赖氨酸取代，其 具有SEQ ID N0:40所公开的序列。应理解，上述恒定区序列可完整使用或仅使用其部分， 例如其CH1、CH2和/或CH3部分。含有可变结构域和恒定结构域的重链的非限制性示例是 SEQ ID N0:79和80的氨基酸序列。本发明所述工程改造的单克隆抗体还可包含任何类型 的轻链免疫球蛋白基因，即κ独特恒定区基因或λ恒定区基因1、2、3、6或7。例如，可以 使用以下轻链恒定区序列：λ恒定区基因3,如SEQ ID Ν0:63的序列，或κ独特恒定区基 因，如SEQ ID Ν0:64的序列。含有可变结构域和恒定结构域的轻链的非限制性示例是SEQ ID NO:81的氨基酸序列。
[0038] 本发明的其他实施方式是一种分离的核酸分子或多核苷酸，其编码本发明所述任 意抗体或其部分，或其互补链或简并序列。在这一方面，术语"核酸分子"或可互换的"多核 苷酸"涵盖所有不同类型的核酸，包括但不限于脱氧核糖核酸（例如DNA、cDNA、gDNA、合成 的DNA等）、核糖核酸（如RNA)和肽核酸（PNA)。在优选的实施方式中，该核酸分子是DNA 分子，例如双链DNA分子或cDNA分子。术语"分离的"指核酸分子已经鉴定并与至少一种 污染核酸分子分离，所述污染核酸分子通常在天然来源中与所述核酸分子结合。分离的核 酸分子不同于其在天然中发现的形式或状态。分离的核酸分子因此可与其在天然细胞中存 在的特定核酸分子区分。简并序列指编码与参考核苷酸序列相同的氨基酸序列的任意核苷 酸序列，但其因为遗传密码简并性而包含不同的核苷酸序列。
[0039] 在另一个实施方式中，核酸分子（也称作多核苷酸）编码本发明的单克隆抗体中 任一种的重链或其部分，例如重链可变结构域，且另一个多核苷酸编码本发明的单克隆抗 体中任一种的轻链或其部分，例如轻链可变结构域。在一个替代性实施方式中，一种独特的 多核苷酸编码本发明的抗体中任一种的重链和轻链或其部分，例如可变结构域或Fab区。
[0040] 在一个优选的实施方式中，编码本发明所述抗体的重链可变结构域的多核苷酸包 含或由以下序列组成：SEQ ID勵:41、43、44、45、46、66、69、71、73、75或77。在一个优选的 实施方式中，编码本发明所述抗体的轻链可变结构域的多核苷酸包含或由以下序列组成： SEQ ID 勵:42、47、48、49、50、67、68、70、72、74、76或78。在一个替代性实施方式中，独特 的多核苷酸编码本发明的抗体中任一种的重链和轻链可变结构域，其中，编码重链可变结 构域的多核苷酸包含或由以下序列组成：SEQ ID勵:41、43、44、45、46、66、69、71、73、75或 77,且编码轻链可变结构域的多核苷酸包含或由以下序列组成：SEQ ID N0:42、47、48、49、 50、67、68、70、72、74、76或78。SEQIDN0:43-46 的初始57个核苷酸、SEQIDN0:41-42、 47-50、66-70、69-75或77-78的初始60个核苷酸，以及SEQ ID NO:76的初始63个核苷酸 或SEQ ID N0:68的初始75个核苷酸编码前导序列。在本发明的上下文中，应理解这些核 苷酸可移除或被编码前导序列的任何其他核苷酸序列的取代。因此，在另一个实施方式中， 编码本发明的抗体的重链可变结构域的多核苷酸包含或由以下序列组成：SEQ ID N0:41的 核苷酸 61-129、SEQ ID N0:43 的核苷酸 58-426、SEQ ID N0:44 的核苷酸 58-426、SEQ ID NO:45 的核苷酸 58-426、SEQ ID NO:46 的核苷酸 58-426、SEQ ID NO:66 的核苷酸 61-399、 SEQ ID N0:69 的核苷酸 61-438、SEQ ID N0:71 的核苷酸 61-420、SEQ ID N0:73 的核苷酸 61-414、SEQ ID N0:75 的核苷酸 61-405 或 SEQ ID N0:77 的核苷酸 61-399。类似地，在一 个优选的实施方式中，编码本发明的抗体的轻链可变结构域的多核苷酸包含或由以下序列 组成 ：SEQIDN0:42的核苷酸61-381、SEQIDN0:47的核苷酸61-381、SEQIDN0:48的 核苷酸 61-381、SEQ ID N0:49 的核苷酸 61-381、SEQ ID N0:50 的核苷酸 61-381、SEQ ID NO:67 的核苷酸 61-378、SEQ ID NO:68 的核苷酸 76-396、SEQ ID NO:70 的核苷酸 61-384、 SEQ ID NO:72 的核苷酸 61-390、SEQ ID NO:74 的核苷酸 61-390、SEQ ID NO:76 的核苷酸 64-384或SEQ ID N0:78的核苷酸61-381。在一个替代性实施方式中，独特多核苷酸编码 本发明的抗体中任一种的重链和轻链可变结构域，其中，编码重链可变结构域的多核苷酸 包含或由以下序列组成：SEQ ID N0:41的核苷酸61-429、SEQ ID N0:43的核苷酸58-426、 SEQ ID NO:44 的核苷酸 58-426、SEQ ID NO:45 的核苷酸 58-426、SEQ ID NO:46 的核苷酸 58-426、SEQIDN0:66的核苷酸 61-399、SEQIDN0:69的核苷酸 61-438、SEQIDN0:71 的核苷酸 61-420、SEQ ID NO:73 的核苷酸 61-414、SEQ ID NO:75 的核苷酸 61-405 或 SEQ ID N0:77的核苷酸61-399,并且编码轻链可变结构域的多核苷酸包含或由以下序列组成： SEQ ID N0:42 的核苷酸 61-381、SEQ ID N0:47 的核苷酸 61-381、SEQ ID N0:48 的核苷酸 61-381、SEQ ID N0:49 的核苷酸 61-381、SEQ ID N0:50 的核苷酸 61-381、SEQ ID N0:67 的 核苷酸 61-378、SEQ ID N0:68 的核苷酸 76-396、SEQ ID N0:70 的核苷酸 61-384、SEQ ID N0:72 的核苷酸 61-390、SEQ ID N0:74 的核苷酸 61-390、SEQ ID N0:76 的核苷酸 64-384 或 SEQ ID NO:78 的核苷酸 61-381。
[0041] 由于遗传密码子的简并性，应理解可优化编码本发明所述抗体的多核苷酸。因此， 还提供了与编码本发明所述重链可变区序列（例如上文列举的优选的多核苷酸序列）至少 90%或以上相同、至少95%或以上相同或至少99%或以上相同的多核苷酸序列。类似地， 还提供了与编码本发明所述轻链可变区序列（例如上文列举的优选的多核苷酸序列）至少 90%或以上相同、至少95%或以上相同或至少99%或以上相同的多核苷酸序列。
[0042] 本发明的另一个实施方式是一种包含DNA的载体，该DNA编码本发明所述单克隆 抗体或其部分，例如可变结构域（重链和/或轻链可变结构域）或Fab区。该载体可以是任 意克隆或表达载体，整合或自动复制，在任何原核或真核细胞中起作用。具体而言，该载体 可以是质粒、粘粒、病毒、噬菌体、原生质体、人工染色体等。该载体可包含重链和轻链的整 个或部分编码序列，或轻链和重链编码序列中的任一种，或其任何部分。如果该载体包含重 链和轻链的编