码序列及其部分，这些编码序列可以各自可操作地连接启动子。对于重链和 轻链编码序列或其部分，该启动子可以是相同的或不同的。重链和轻链编码序列或其部分 还可可操作地连接单个启动子，此时重链和轻链的编码序列或其部分可优选由内部核糖体 进入位点（IRES)隔开。用于真核基因病毒的合适启动子是，例如，衍生自病毒基因（如鼠 或人巨细胞病毒（CMV))的启动子、小鼠双向CMV启动子、劳斯氏肉瘤病毒（RSV)启动子或 人延长因子-la (EF-Ia)启动子，其是本领域技术人员熟知的。该载体可包含调控元件， 例如启动子、终止子、增强子、选择标志物、复制起点、绝缘子等。适当的核酸序列可通过多 种方法插入载体。通常，使用本领域已知的方法将DNA插入适当限制性内切酶位点。含有 一种或多种这些组分的合适载体的构建使用本领域技术人员已知的标准连接技术。
[0043] 本发明的另一个实施方式是一种重组宿主细胞，所述细胞包含一种或多种上文所 述核酸分子/多核苷酸或一种或多种上文所述载体。该宿主细胞可以是原核或真核细胞。 原核细胞的示例包括细菌，例如大肠杆菌。真核细胞的示例是酵母细胞、植物细胞、哺乳动 物细胞和昆虫细胞，包括任何原代细胞培养物或建立的细胞系（例如3T3、Vero、HEK293、 TN5等）。合适的用于表达糖基化蛋白质的宿主细胞来自多细胞生物体。优选的有用的哺 乳动物宿主细胞系的示例包括CHO、HEK293、NSO、SP2/0和COS细胞。本发明的抗体可通过 本领域已知的任何技术生产，例如通过重组技术、化学合成、克隆、连接或其组合。如果需要 获得具有较低糖基化水平的抗体、非糖基化抗体或其非糖基化部分（如非糖基化Fc部分）， 可有利地使用酵母表达系统或工程改造的/糖工程改造的CHO细胞系。类似地，如果需要 获得具有较低岩藻糖基化水平的抗体、非岩藻糖基化抗体或其非岩藻糖基化部分（如非岩 藻糖基化Fc部分），可有利地使用工程改造的/糖工程改造的酵母表达系统或工程改造的 /糖工程改造的CHO细胞系。
[0044] 本发明的另一个实施方式因此是一种生产本发明的抗体或其部分（如可变结构 域（重链和/或轻链可变结构域）或Fab区）的方法，该方法包括在允许编码本发明所述 抗体中任一种或其部分的核酸分子进行表达的条件下培养本发明的重组宿主细胞，并回收 /分离生产的多肽。生产的多肽可以是糖基化或非糖基化的，可以是岩藻糖基化或非岩藻糖 基化的，或可含有其他翻译后修饰，这取决于使用的宿主细胞。生产本发明的抗体或其部分 的方法还可包括以下步骤：纯化该抗体或其部分，和/或将所述抗体或其部分配制为药物 组合物。
[0045] 用于制备编码本发明所述抗体（包括其部分，如可变结构域（重链和/或轻链可 变结构域）或Fab区）的多核苷酸（包括DNA和RNA)的其他方法是本领域熟知的。可使用 异硫氰酸胍提取并随后在CsCI梯度中提供离心分离来制备总RNA(Chirgwin JM等1979)。 使用Aviv和Leder的方法从总RNA中制备Poly (A)+RNA (Aviv H等1972)。使用已知方法 由poly (A)+RNA制备互补DNA(cDNA)。或者，可分离基因组DNA。编码CXCR5抗体或其部分 的多核苷酸可随后通过例如杂交或PCR进行鉴定和分离。
[0046] 可通过本领域已知的任何技术生产本发明所述抗体（包括其部分，如可变结构域 (重链和/或轻链可变结构域）或Fab区），例如重组技术、化学合成、克隆、连接或其组合。 许多书和综述教导了如何使用载体和原核或真核宿主细胞来克隆和生产重组蛋白。
[0047] 本发明的另一个实施方式是一种药物组合物，其包含本发明所述单克隆抗体或其 部分，例如可变结构域（重链和/或轻链可变结构域）或Fab区。优选地，所述药物组合物 还可包含至少一种其他赋形剂，例如缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、运载体、稀释剂、载剂等。
[0048] 本发明的药物组合物可用于诊断、预防和/或治疗（局部或系统性）炎性或自身 免疫疾病/病症（如多发性硬化、类风湿性关节炎或舍格伦综合征）以及多种类型的癌症 (如胰腺癌、B-CLL或涉及CXCR5/CXCL13通路的任何类型癌症）。本发明的药物组合物可 与药学上可接受的运载体一起给予。
[0049] 在另一个方面中，本发明提供了用作药物的本发明所述单克隆抗体或其部分，例 如可变结构域（重链和/或轻链可变结构域）或Fab区。具体而言，其可用于治疗炎性或 自身免疫疾病/病症。优选地，所述疾病/病症选自MS、RA或舍格伦综合征。在另一个方 面中，本发明提供了一种治疗患者中疾病的方法，包括给予患者本发明所述任意抗体或其 部分或药物组合物。优选地，该疾病炎性或自身免疫疾病/病症，例如MS、RA或舍格伦综合 征。在另一个方面中，本发明涉及治疗癌症的方法，包括给予患者本发明所述任意抗体或其 部分或药物组合物。优选地，该癌症是胰腺癌、B-CLL或涉及CXCR5/CXCL13通路的任何类 型癌症。
[0050] 在另一个方面中，本发明提供了本发明所述单克隆抗体在制备用于治疗炎性或自 身免疫疾病/病症以及癌症的药物中的应用。优选地，所述炎性或自身免疫疾病/病症选 自MS、RA或舍格伦综合征。优选地，所述癌症是胰腺癌、B-CLL或涉及CXCR5/CXCL13通路 的任何类型癌症。
[0051 ] 本发明所述药物组合物可以任何合适方式给予，例如静脉内、肌内、皮下或皮内。
[0052] 对于胃肠道外（例如静脉内、皮下、肌内、皮内）给药，本发明的药物组合物可与药 学上可接受的胃肠道外载剂（例如水、盐水、右旋糖溶液）和维持等张性（例如甘露醇）或 化学稳定性（例如防腐剂和缓冲剂）的添加剂一起配制为溶液、悬浮液、乳液或冻干粉末。 可通过通常使用的技术对该制剂进行灭菌。
[0053] 给予个体的剂量可根据多种因素变化，包括药代动力学特性、给药途径、患者状态 和特征（尤其是性别、年龄、体重、健康和体型）、症状程度、共同治疗、治疗的频率和所需效 果。本发明的抗体或其部分（例如可变结构域（重链和/或轻链可变结构域）或Fab区） 可以其他替代形式生产、配制、给予或使用，这些形式优选根据所需使用和/或生产方法。 还可生成有用的偶联物或复合物以在药物递送效力方面改进试剂。出于该目的，本发明所 述抗体可以是具有诸如聚乙二醇和其他天然或合成的聚合物的分子的活性偶联物或复合 物的形式（Harris JM等2003)。在这方面，本发明考虑化学修饰的抗体，其中抗体连接聚合 物。通常，该聚合物是水溶性的，从而偶联物不会在水性环境（如生理环境）中沉淀。此外， 可使用聚合物的混合物来生产偶联物。用于治疗的偶联物可包含药学上可接受的水溶性聚 合物部分。合适的水溶性聚合物包括聚乙二醇（PEG)、单甲氧基-PEG、芳氧基-PEG、碳酸双 琥珀酰亚胺酯PEG、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化的多元醇（如 甘油）、聚乙烯醇、右旋糖酐、纤维素或其他基于碳酸酯的聚合物。合适的PEG的分子量是约 600至约60, 000,包括例如5, 000、12, 000、20, OOO和25, 000。偶联物还可包含这类水溶性 聚合物的混合物。偶联物的示例包括上文所述的任何抗体和与N末端相连的聚烷基氧化物 部分。PEG是一种合适的聚烷基氧化物。例如，可使用PEG修饰本发明公开的任意抗体，称 作"PEG化"。可通过本领域已知的任意PEG化反应进行PEG化（Francis GE等1998)。例 如，可使用反应性聚乙二醇分子通过酰化反应或通过烷基化反应来进行PEG化。优选地，这 些修饰都不会显著影响抗体结合人或猕猴（如食蟹猴）CXCR5的能力。
[0054] 本发明还包括针对人和/或猕猴（如食蟹猴）CXCR5的重组抗体或其部分，如可变 结构域（重链和/或轻链可变结构域）或Fab区，其在功能上等同于上文所述的那些。还 包括经修饰的抗体或其部分，其提供改进的稳定性和/或治疗功效。经修饰的抗体或其部 分的示例包括具有氨基酸残基保守取代以及一个或多个氨基酸缺失或插入（其不明显不 利地改变抗原结合应用性）的那些。取代的范围可以是从改变或修饰一个或多个氨基酸残 基至完全重新设计某一区域，前提是维持治疗应用性。本发明的抗体或其部分可经翻译后 修饰（例如乙酰化、氧化、脱酰胺化、外消旋化和磷酸化）或可经合成修饰（例如连接标记 基团）。应理解，通过本方法设计的抗体或其部分可具有其他保守性氨基酸取代，其基本不 影响抗原结合或其他免疫球蛋白功能。
[0055] 本发明的单克隆抗体或其部分（如可变结构域（重链和/或轻链可变结构域）或 Fab区）可包含衍生物。例如但不限于，这些衍生物包括通过，例如糖基化、乙酰化、PEG化、 磷酸化、酰胺化、由已知保护/阻断基团衍生、蛋白水解切割、连接于细胞配体或其它蛋白 质等方法修饰的抗体。此外，衍生物可包含一种或多种非经典和/或非天然氨基酸。可通 过修饰（例如取代、删除或添加）经鉴定涉及Fc区与FcRn受体相互作用的氨基酸残基来 提高本发明的单克隆抗体的体内半衰期。
[0056] 本文应用的所有参考文献，包括杂志文章或摘要、专利申请或任何其他参考文献， 都通过引用全文纳入本文，包括所引用参考文献中的所有数据、表格、附图和文本。此外，本 文所引用的参考文献内所引用的参考文献的全部内容也通过引用全文纳入本文。
[0057] 以上【具体实施方式】的描述完全揭示了本发明的一般性质，通过应用本领域技术范 围内的知识（包括本文所引用参考文献的内容），他人无需过多实验即能容易地就各种应 用改良和/或修改这些【具体实施方式】，而不背离本发明总体理念。因此，基于本文所列出的 教导和指南，应理解为这些修改和改良落入所公开实施方式的等同形式的含义和范围内。 应理解，本文使用短语和术语的目的是描述而非限制。
【附图说明】：
[0058] 图1显示可变重链的可变区氨基酸序列的比对并显示这2种变体之间构架区和 CDR中氨基酸序列的差异，其使用人种系免疫球蛋白重链可变3-23 (IGHV3-23*01)和人种 系免疫球蛋白重链接合基团4(IGHJ4*02)。
[0059] 图2显示可变轻链的可变区氨基酸序列的比对并显示这三种变体之间构架区和 ⑶R中氨基酸序列的差异，其使用人种系免疫球蛋白轻链可变1-27 (IGKV1-27*01)和人种 系免疫球蛋白κ接合基团5(IGKJ5*01)。
[0060] 图 3 :3 种形式的 40C01 mAb(40C01VH-VL、40C01VHl-Vkl 和 40C01VH1-Vk2)的 DSC分析结果。四种全人IgGl抗体，抗CXCR5 40C01母体分子（40C01 VH-VL)、与轻链变 体I (VHl-Vkl)配对的抗CXCR5 40C01重链变体1、与轻链变体2 (VH2-Vk2)配对的抗CXCR5 40C01重链变体1以及同种型对照的热解折叠曲线。所有四种IgGl构建体的CH2和CH3结 构域的解折叠转变都是相同的，而Fab解折叠转变高度可变。
[0061] 图4 :40C01VH1-Vk3和40C01VH2-Vk3变体获得的热分析图特征。三种全人IgGl 抗体，与轻链变体3 (VH1-Vk3)配对抗CXCR5 40C01重链变体1、与轻链变体3 (VH2-Vk3)配 对抗CXCR5 40C01重链变体2以及同种型对照的热解折叠曲线。所有四种IgGl构建体的 CH2和CH3结构域的解折叠转变都是相同的，而两种抗CXCR5 40C01变体的Fab解折叠转变 都远高于（80°C以上）同种型对照。
[0062] 图5 :表达人（组图A至F)和猕猴（G和H) CXCR5的LI. 2细胞的CXCL13刺激的 趋化性的抑制，其由以全抗体形式表达为IgGU IgG2和IgG4的抗CXCR5 40C01-VH1-Vk3 和40C01-VH2-Vk3变体导致。针对基线活性（仅介质）和使用IOnM CXCL13获得最大应答 (100%)对结果进行标准化。显示的数据代表三次独立实验。所有点都重复三次（误差线 显不 +/_S. E. M)。
[0063] 图6 :显示以全抗体形式表达为IgGl的抗CXCR5 40C01-VH1-Vk3(组图A)和 40C01-VH2-Vk3 (组图B)变体所导致的原代人B细胞的人CXCL13刺激的趋化性的抑制的 代表性示例。这些结果表达为经计算的IC5。（半最大抑制浓度）。数值为分别来自8次 (40C01-VH1-Vk3)和 5 次（40C01-VH2-Vk3)单独实验的平均值 +/-S. E. M。
[0064] 图7 :Alexa-Fluor 647标记的抗CXCR5 40C01变体与使用人CXCR5稳定转染的 HEK-293细胞的结合
[0065] 图8 :Alexa-Fluor 647标记的抗CXCR5 40C01变体与全血中人B细胞的结合
[0066] 图9 :抗CXCR5 40C01变体与全血中猕猴B细胞的结合
[0067] 图10 :抗CXCR5 mAb对人全血中B细胞中CXCL13刺激的磷酸化的抑制
[0068] 图11 :抗CXCR5 mAb对猕猴全血中B细胞中CXCL13刺激的磷酸化的抑制
[0069] 图12 :使用KinExA方法测定抗CXCR5 mAb 40C01-VH1-Vk3变体对细胞膜表达的 CXCR5的KD。在0· 02% NaN3存在的情况下使用30pM(实心菱形）或300pM(空心圆形）活 性结合位点浓度的抗CXCR5 mAb 40C01-VH1-Vk3连续稀释并孵育CXCR5-HEK-293细胞（5x lOVml)并使之平衡。测量上清液中残留的游离mAb。（A)游离mAb百分比针对抗原浓度作 图（任意提取每100万个细胞等于10 9M抗原）。进行使用未知抗原方法的多重曲线分析 ("η-曲线分析"）来确定Kd和抗原乘数（antigen multiplier)的最佳值（分别为B和 C)。通过反复改变Kd和抗原乘数的最佳值同时将其他参数保持为其最佳值来确定95%置 信区间。
[0070] 图13 :使用KinExA方法测定抗CXCR5 mAb 40C01-VH2-Vk3变体对细胞膜表达的 CXCR5的KD。在0· 02% NaN3存在的情况下使用IOOpM(实心菱形）或InM(空心圆形）活 性结合位点浓度的抗CXCR5 mAb 40C01-VH1-Vk3连续稀释并孵育CXCR5-HEK-293细胞（5x lOVml)并使之平衡。测量上清液中残留的游离mAbo (A)游离mAb百分比针对抗原浓度作 图（任意提取每100万个细胞等于10 9M抗原）。进行使用未知抗原方法的多重曲线分析 ("η-曲线分析"）来确定Kd和抗原乘数（antigen multiplier)的最佳值（分别为B和 C)。通过反复改变Kd和抗原乘数的最佳值同时将其他参数保持为其最佳值来确定95%置 信区间。
[0071] 图14 :从靶向51Cr标记的人B细胞的外周血单核细胞（PBMC)中纯化的人NK细 胞的抗CXCR5介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC)。
[0072] 图15 :表达人（组图A)或猕猴（组图B)CXCR5的靶向51Cr标记的LL 2细胞的 人PMBC的抗CXCR5介导的ADCC。在相同的试验条件下将相同的效应物/靶细胞混合物与 抗CXCR5 mAb孵育，所述抗CXCR5 mAb使用标准糖基化内容物制备（40C01-VHl-Vk3-IgGl) 或制备为非岩藻糖化抗体（40C01-VHl-Vk3-IgGl_低_岩藻糖）。
[0073] 图16 :抗CXCR5抗体诱导的人B细胞消耗。在所示抗体浓度范围存在的情况下将 人PBMC(5x 106/ml)培养过夜。从5个供体中通过流式细胞术评估淋巴细胞门选中⑶19+B 细胞的百分比。将各供体的数据标准化至同种型对照并合并5个供体的数据（POC=对照 百分比）。显示平均值土SEM。
[0074] 序列说明：
[0075] SEQ ID NO: I :mAb 40C01和12A01的重链可变区（氨基酸序列）
[0076] SEQ ID N0:2 :mAb 40C01的轻链可变区（氨基酸序列）
[0077] SEQ ID N0:3 :mAb 40C01-VH1的重链可变区（氨基酸序列）
[0078] SEQ ID N0:4 :mAb 40C01-VH2的重链可变区（氨基酸序列）
[0079] SEQ ID N0:5 :mAb 40C01-Vkl的轻链可变区（氨基酸序列）
[008