0] SEQ ID N0:6 :mAb 40C01-Vk2的轻链可变区（氨基酸序列）
[0081] SEQ ID N0:7 :mAb 40C01-Vk3的轻链可变区（氨基酸序列）
[0082] SEQ ID N0:8-19 :40C01系列的mAb的CDR序列（氨基酸序列）
[0083] SEQ ID NO: 20-34 :40C01系列的mAb的FR序列（氨基酸序列）
[0084] SEQ ID NO: 35 :人 CXCR5 (氨基酸序列）
[0085] SEQ ID NO: 36 :食蟹猴CXCR5 (氨基酸序列）
[0086] SEQ ID NO:37 :恒河猴（氨基酸序列）
[0087] SEQ ID NO:38 :重链恒定区-人IgGl，同种异型Glm(f)(氨基酸序列）
[0088] SEQ ID N0:39 :重链恒定区-人IgG2 DI-NQ-HC2h亚型（氨基酸序列）
[0089] SEQ ID N0:40 :重链恒定区-人IgG4 S228P-R409K亚型（氨基酸序列）
[0090] SEQ ID N0:41 :mAb 40C01的重链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-60编 码前导序列。
[0091] SEQ ID N0:42 :mAb 40C01的轻链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-60编 码前导序列。
[0092] SEQ ID N0:43 :mAb 40C01-VH1的重链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-57 编码前导序列。
[0093] SEQ ID N0:44 :mAb 40C01-VH1的重链可变区（密码子优化的核酸序列）。该序列 的核苷酸1-57编码前导序列。
[0094] SEQ ID N0:45 :mAb 40C01-VH2的重链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-57 编码前导序列。
[0095] SEQ ID N0:46 :mAb 40C01-VH2的重链可变区（密码子优化的核酸序列）。该序列 的核苷酸1-57编码前导序列。
[0096] SEQ ID N0:47 :mAb 40C01-Vkl的轻链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-60 编码前导序列。
[0097] SEQ ID N0:48 :mAb 40C01-Vk2的轻链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-60 编码前导序列。
[0098] SEQ ID N0:49 :mAb 40C01-Vk3的轻链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-60 编码前导序列。
[0099] SEQ ID N0:50 :mAb 40C01-Vk3的轻链可变区（密码子优化的核酸序列）。该序列 的核苷酸卜60编码前导序列。
[0100] SEQ ID N0:51 :mAb优化的42R)3的重链可变区
[0101] SEQ ID N0:52 :mAb优化的42R)3的轻链可变区
[0102] SEQ ID N0:53 :mAb 80A10 的重链可变区
[0103] SEQ ID N0:54 :mAb 80A10 的轻链可变区
[0104] SEQ ID N0:55 :mAb 80A11 的重链可变区
[0105] SEQ ID N0:56 :mAb 80A11 的轻链可变区
[0106] SEQ ID N0:57 :mAb 80B09 的重链可变区
[0107] SEQ ID N0:58 :mAb 80B09 的轻链可变区
[0108] SEQ ID N0:59 :mAb 80D11 的重链可变区
[0109] SEQ ID N0:60 :mAb 80D11 的轻链可变区
[0110] SEQ ID N0:61 :mAb 42F03 的重链可变区
[0111] SEQ ID N0:62 :mAb 42F03 的轻链可变区
[0112] SEQ ID N0:63 :轻链恒定区-λ恒定区基因3 (氨基酸序列）
[0113] SEQ ID NO: 64 :轻链恒定区-κ独特恒定区基因3 (氨基酸序列）
[0114] SEQ ID N0:65 :mAb 12A01 的轻链可变区
[0115] SEQ ID N0:66 :mAb优化的42R)3的重链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸 1_60编码前导序列。
[0116] SEQ ID N0:67 :mAb优化的42F03的轻链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸 1_60编码前导序列。
[0117] SEQ ID N0:68 :mAb 80A10的轻链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-75编 码前导序列。
[0118] SEQ ID N0:69 :mAb 80A10的重链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-60编 码前导序列。
[0119] SEQ ID N0:70 :mAb 80A11的轻链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-60编 码前导序列。
[0120] SEQ ID N0:71 :mAb 80A11的重链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-60编 码前导序列。
[0121] SEQ ID NO:72 :mAb 80B09的轻链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-60编 码前导序列。
[0122] SEQ ID N0:73 :mAb 80B09的重链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-60编 码前导序列。
[0123] SEQ ID N0:74 :mAb 80D11的轻链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-60编 码前导序列。
[0124] SEQ ID N0:75 :mAb 80D11的重链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-60编 码前导序列。
[0125] SEQ ID N0:76 :mAb 42F03的轻链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-63编 码前导序列。
[0126] SEQ ID N0:77 :mAb 42F03的重链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-60编 码前导序列。
[0127] SEQ ID N0:78 :mAb 12A01的轻链可变区（核酸序列）。该序列的核苷酸1-60编 码前导序列。
[0128] SEQ ID NO:79 :mAb 40C01-VHl-IgGl 的重链（氨基酸序列）
[0129] SEQ ID N0:80 :mAb 40C01-VHl-IgG2_DI-NQ-HC2h-亚型的重链（氨基酸序列）
[0130] SEQ ID N0:81 :mAb 40C01-Vk3-c-K 的轻链（氨基酸序列）
[0131] 实施例1-发现
[0132] I. 1.表达人和猕猴CXCR5的稳定细胞系的生成
[0133] 通过基因合成来生成密码子优化的编码人CXCR5(基于NCBI参考号NM_001716. 3， 其编码SEQIDN0:35的氨基酸序列）和猕猴（食蟹猴（Macacafascicularis))CXCR5(参 见SEQ ID N0:36)的cDNA，其具有或不具有C末端标签。食蟹猴CXCR5的序列无法在 公共数据库中获得。因此，使用基于人CXCR5和恒河猴（Macaca mulatta)(NCBI参考号 XM_001100017. 2,其编码SEQ ID N0:37的氨基酸序列）的简并寡核苷酸引物，通过RT-PCR 从短尾猴脾cDNA(购自生物链公司（Biochain))中克隆cDNA序列。将全长cDNA亚克隆至 哺乳动物细胞表达载体pcDNA4(英杰公司（Invitrogen))中。通过使用市售可得的转染试 剂（如Gene Porter (吉兰蒂斯公司（Genlantis)))进行转化以生成过表达密码子优化的 hCXCR5的稳定细胞系：中华仓鼠卵巢细胞CH0-hCXCR5 ;犬胸腺细胞系Cf2Th-hCXCR5 ;仓鼠 成纤维细胞细胞系R1610-hCXCR5 ;人胚胎肾细胞系HEK293-hCXCR5和过表达密码子优化的 食蟹猴CXCR5的稳定细胞系：中华仓鼠卵巢细胞cCXCR5-CH0。使用新霉素（G418)选择表 达转染的CXCR5基因的细胞。使用市售可得的抗CXCR5 mAb(mAb 190，R&D系统公司（R&D systems))，通过FACs分析来鉴定对新霉素耐受且在细胞表面上表达高水平CXCR5的稳定 克隆。
[0134] 1. 2.表达CXCR5的顺磁性蛋白脂质体（PMPL)的制备
[0135] 通过MSM蛋白技术制备含有人或食蟹猴CXCR5的顺磁性蛋白脂质体（PMPL)，其中 使用基于Mirzabekov等（2000)所述方法的MSM专有技术。简言之，收获过表达CXCR5的 细胞，并在专有的去垢剂混合物中溶解细胞膜。无孔顺磁性珠的表面共价偶联链霉亲和素 和识别CXCR5上C末端标签的抗体。这些偶联的珠用于捕获来自溶解的细胞裂解物的带C 末端标签的CXCR5。充分清洗以除去污染物后，将珠与含有0. 1 - 1%的生物素-DOPE的去 垢剂溶解的脂质混合。通过透析除去去垢剂，其中脂质双层膜在珠周围自动组装且CXCR5 回到其原始环境中。市售抗hCXCR5-PE偶联的抗体（R&D系统公司）被用于通过Guava? easyCyte流式细胞术（密理博公司（Millipore))显示珠含有正确取向的CXCR5(即胞外部 分暴露在珠的表面上）。用于生成hCXCR5-PMPL的条件也用于生成食蟹猴CXCR5的PMPL。
[0136] 1. 3.使用噬菌体展示技术生成抗CXCR5抗体。
[0137] 使用噬菌体展示技术鉴定针对来自DYAX的人Fab-噬菌体410抗体文库的CXCR5 的中和抗体，其中使用携带CXCR5的PMPL作为靶标。使用若干不同的选择臂来选择特异性 结合人CXCR5的Fab (4-5轮选择）或结合人和食蟹猴CXCR5的交叉反应性Fab (使用针对 人和食蟹猴CXCR5的交替选择轮次）。
[0138] 将分离自第3轮选择输出的约9535个克隆的Fab重排至表达载体 pXPls-SacB(DYAX)中并使用IPTG(K)O μM)诱导18小时后在96或24孔板中在大肠杆菌 BL21 Gold细胞中表达，基本如Hoet等（2005)所述。通过与过表达CXCR5的人或食蟹猴细 胞系在室温（RT)下孵育40分钟来筛选含有可溶性分泌Fab的培养介质。清洗掉未结合的 Fab，随后将细胞与抗c-Myc小鼠单克隆抗体（9E10)在室温下孵育20分钟。清洗掉未结合 的Fab，并将细胞与抗小鼠 IgG-PE标记的二抗在室温下孵育20分钟。随后将细胞清洗两 遍，固定并使用.Guavif? FACS酶标仪分析。
[0139] 鉴定到了显示人-食蟹猴CXCR5交叉反应性的973个克隆。在进行序列分析后， 鉴定到了 168条独特序列，其中46条具有独特的重链⑶R3序列（数据未显示）。随后将所 有感兴趣的克隆都在哺乳动物细胞表达载体PTT5中重排为全人IgGl (加拿大国家研究委 员会，参见申请US20110039339)，在ΗΕΚ293细胞中瞬时表达并纯化用于在基于细胞的试验 中测试。
[0140] 1.4.抗体表达和纯化
[0141] 将抗体重链和轻链单独亚克隆至ρΤΤ5载体中并在使用聚乙烯亚胺（PEI)转染试 剂转染后在适应于悬浮培养的ΗΕΚ293细胞中瞬时共表达。将细胞在5% CO2潮湿培养箱中 37°C下振荡孵育3天。收获并离心条件培养基以除去细胞碎片。使用标准方法通过蛋白A 亲和层析从培养物上清液中纯化抗体，在Sephadex G25上对抗体脱盐并在所有试验中都在 PBS中配制抗体（FLIPR钙试验除外，其在TBS中配制抗体）。对于大规模抗体制备（大于 400ml培养物），在Superdex-200树脂上进行额外的尺寸排阻色谱（SEC)步骤以除去聚集 物。对纯化的蛋白进行以下QC分析：还原和非还原条件下的SDS PAGE:用于测定纯度和表 观Mff的SEC;用于浓度测定的UV光谱。使用Endosafe PTS试验测量内毒素污染。通常从 50ml培养物中获得l-5mg的纯化的抗体。
[0142] 1. 5.针对抗CXCR5 Fab的基于细胞的结合试验
[0143] 通过FACS评估抗CXCR5抗体与表达人CXCR5或物种直向同源物的原代细胞和细 胞系的结合。简言之，将约IxlO 5个表达CXCR5的细胞悬浮在含有浓度逐渐升高的抗CXCR5 抗体（范围为0-100 μ g/ml)的FACS缓冲液（含有1 % FBS和0.02%叠氮化钠）中，并在 4°C下孵育20分钟。清洗细胞并随后重悬在含有PE标记的山羊抗人IgG(杰克逊实验室公 司（Jackson Labs))的FACS缓冲液中，4°C下反应20分钟。随后将细胞清洗3次并重悬在 100 μ I FACS缓冲液中并在FACScalibur仪器（BD科学公司（BD Sciences))上分析。将 MFI针对抗体浓度作图并使用Graph pad prism软件计算EC5。值。
[0144] mAb 80A11、80A10、80B09有针对人CXCR5的高度特异性（数据未显示）。42R)3、 12A01、40C01和80D11结合人和食蟹猴CXCR5 (数据未显示）。实施例1. 3中鉴定到的抗体 都不与大鼠或小鼠 CXCR5交叉反应。
[0145] 1. 6. FLIPR钙移动试验
[0146] 使用Calcium 5试验试剂盒（分子装置公司（Molecular Devices))在FLIPR试验 中测定表达CXCR5的细胞中抗CXCR5抑制CXCL13诱导的胞内钙移动（钙流）的能力。将 R1610-hCXCR5细胞以每孔40, 000-60, 000个细胞置于96孔平底组织培养板中的CHO-S-SFM II无血清培养基（吉布科公司（Gibco))中并在37°C下在潮湿的5% 0)2培养箱内孵育过 夜以允许细胞粘附到孔的底部并形成单层，其融合度接近100%。根据试剂盒制造商的实验 方案使用染料加载细胞，随后使用浓度逐渐升高（最高至1 μΜ)的抗CXCR5抗体在37°C下 预孵育 1 小时，清洗，随后暴露于 130nM CXCL13。在 Molecular Devices FLEXstation III 仪器上监测钙流的变化。实施例1. 5中鉴定到的所有抗体都能够抑制CXCL13诱导的胞内 钙流（数据未显示）。
[0147] 1.7.趋化性试验
[0148] 在趋化性试验系统中测定抗CXCR5抗体抑制过表达CXCR5的LI. 2细胞的CXCL13 诱导的迀移的能力。出于该目的，生成使用人或食蟹猴CXCR5稳定转染的小鼠前B细胞系 LL 2。使用克隆至哺乳动物细胞表达载体pcDNA3.1 hygro DEST(英杰公司（Invitrogen)) 的人或食蟹猴CXCR5 cDNA通过电穿孔转染维持在含有5 %热灭活FCS、2mM谷氨酰胺和 50 μ M巯基乙醇的RPMI介质中的LI. 2细胞。在含有600 μ g/ml潮霉素的介质中选择表达 CXCR5的细胞，并在12-14天后通过在96孔组织培养板中以0. 3个细胞/孔接种细胞来进 行单细胞克隆。使用来自R&D系统公司的抗CXCR5抗体（mAb 190)通过FACs测试生长出 的克隆的CXCR5表达。扩增一个表达高水平CXCR5的克隆（LI. 2/CXCR5克隆19)用于进一 步应用。
[0149] 对于趋化性试验，以0. 7x IO6个细胞/ml悬浮LI. 2/CXCR5细胞并使用浓度逐渐升 高的抗CXCR5抗体（0 - I. 0 μ M)在37°C下孵育30分钟。随后将细胞添加至具有8 μ m孔径 滤器的Neuroprobe ChemoTx 96孔趋化性系统的顶部腔体，其在底部微板腔体中含有IOnM CXCL13。使用上盖覆盖组件并在5% 0)2脉冲的潮湿空气培养箱内37°C下孵育5小时。5小 时后，根据生产商的说明，移开滤器并将下方腔体中迀移的细胞转移至96孔平底黑板中。 转移后，密封黑板并将其置于_80°C冷冻器中持续1-2小时或过夜以冷冻细胞。随后将细胞 在室温下解冻20分钟并使用CyQuant (英杰公司）染色。在Synergy?H4酶标仪（伯腾仪 器公司（B