亚砜），并在具有细胞 (2xl06个细胞/ml)的RM中稀释1000X，得到浓度10 μΜ。在孵育器中在37°C将悬浮液孵 育30分钟，然后用RM洗涤3次以除去过量的钙黄绿素。最后，将细胞重悬于RM中（4xl0 6 个细胞/ml)。
[0178] 通过 Boyden 室技术，使用 FluoroBlok? 3 μπι 孔径 96-孔（目录号 351161. BD Falcon (VWR))评价迀移。上室，即包含Fluoroblok膜的插入物，用人纤维蛋白原（目录 号F3879-1G，Sigma)在lmg/ml PBS中在37°C包被2小时。洗涤后，将膜用包含2%牛血清 白蛋白（BSA)的PBS溶液封闭。在使用RM另一次洗涤后，将具有或没有C5aR拮抗剂的IO 5 个钙黄绿素负载的PMN加入至各孔，并置于接收板（下室）中，其包含对照溶液或化学引诱 物hC5a (Sigma, C5788)。各组包含至少6个孔。其后在读板器（SpectraMax, Molecular 装置或 Fluoroscan, Thermo Labsystems.)上，在 37°C 每 5 分钟在 485/538nm 测量板，持续 60分钟。在30分钟以相对荧光单位的值用作迀移的度量。
[0179] 曲线拟合。C5aR诘抗剂抑制迀移的能力可表示为IC50,如使用GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, Inc.)所测定。
[0180] 亲和力的离体测量 在体外设置中，该测定法测量C5aR拮抗剂中和C5a介导的作用的能力。
[0181] 从新鮮人血液中分离嗜中件粒细朐 将血液以 1:1 用 PBS + 2% FBS 稀释，在 Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare #17-1440-03)上分层，比率为3份Ficoll和4份血液（15 ml Ficoll和20ml血液在50 ml 管中），随后在RT下通过以400 X g离心30分钟分层。通过抽吸，轻轻取出中间体PBMC条 带。将在压紧的红细胞上分层的粒细胞用塑料Pasteur移液管吸出。将粒细胞和红细胞转 移和沉淀在新的50 ml管中。沉淀用lx PBS稀释至40 ml，加入10 ml的4% DEXTRAN 500 (sigma，31392)的PBS溶液（比率1:5)，并通过倒置轻轻混合。20-30分钟后，将获得的 粒细胞富集的上清液转移至新管中，在室温下在250 X g回旋5分钟。通过重悬细胞沉淀 于7. 5 ml的0.2 % NaCl和轻轻混合55-60秒，用渗透溶解除去污染的红细胞。随后，加入 17. 5 ml的1. 2 % NaCl，然后用PBS稀释至50 ml，并在250 X g回旋5分钟。将该步骤重 复一次。随后，将细胞沉淀重悬于I ml反应混合物（dPBS/RPMI)中。成活力和细胞计数使 用 NucleoCounter? 监测。
[0182] 对嗜中性粒细胞的竞争配体结合测定法 将人嗜中性粒细胞纯化、洗涤并以约5 X IO6个细胞/ml重悬于结合缓冲液（50 mM HEPES, pH 7.5，I mM CaCl2, 5 mM MgCl2 和 0.5% 牛血清白蛋白（级分 V 无 IgG))。对 于各样品，将40 μ 1细胞悬液（I X IO5个细胞/孔）接种在96-孔V-形板中（Greiner, Cat.# 651101)。使用12个浓度的竞争未标记配体以半-log稀释进行竞争研究，自1 μΜ 作为最高浓度开始。考虑到最终测定体积为120 μL，加入40 μL的C5aR拮抗剂。将40 μL放射性配体[125I]_hC5a (Perkin Elmer,目录号NEX250)添加至所有样品，除了背景 对照。测定法中的放射性配体的终浓度为I nM和终体积为120 μL。所有样品一式三份运 行，和在4°C孵育4h。然后通过以1200 rpm在4°C离心2分钟收集细胞，和用100 μ 1的 洗涤缓冲液（50 mM HEPES, pH 7. 5，I mM CaCl2, 5 mM MgCl2, 150 mM NaCl 和 0· 5% 牛 血清白蛋白（级分V无 IgG))洗涤三次。最后，将细胞重悬于30 μ 1洗涤缓冲液，转移至 OptiPlate (Perkin Elmer,目录号 6005290)，并加入 150 μ 1 的 MicroScint 20 (Perkin Elmer,目录号6013621)至各孔。将板覆盖，充分混合，在校正的Top Counter上以Ih延 迟计数。加入至测定中的放射性配体的总数在单独板上测定。各样品的计数数量表示为以 百分比计的标准化值，其中100%是当加入I nM [125I]-hC5a和无冷的C5aR拮抗剂时的最 大计数水平，和〇%是在1 μ M冷的C5a存在时测定的非特异性结合。通过非线性回归，使 用 PRISM (GraphPad)分析数据。
[0183] 钙流测定法 用Fluo-4 AM细胞染料对人嗜中性粒细胞染色 将嗜中性粒细胞离心和用PBS洗涤，然后以I X IO7个细胞/ml重悬于细胞染料和在 室温下在暗室中孵育40分钟。将细胞离心和洗涤（以除去过量染料），再次离心和以2 X IO6个细胞/ml重悬于细胞缓冲液。将细胞（0.5 ml)等分至非无菌的玻璃FACS管中，各样 品一管，在室温下储存并在2小时内使用。各样品使用I X IO6个嗜中性粒细胞。
[0184] 测定法 钙流测定法如下进行。简言之，在FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences)上，利用 用X-轴FSC vs. y-轴SSC门控的嗜中性粒细胞分析在0. 5 ml细胞缓冲液中负载有Fluo-4 AM的I X IO6个嗜中性粒细胞。向管中加入各种试剂后（例如C5aR拮抗剂、C5a、伊屋诺霉 素-以IOx终浓度溶于细胞缓冲液而不是I-MGB或C-MGB)，FL-I (FITC)通道用于测量嗜 中性粒细胞荧光。用每1秒获得的平均荧光强度（MFI)值连续测量样品荧光。该数据保存 在 CellQuest (BD Biosciences)文件中，并转移至 Excel (Microsoft)和 Prism (v4. Oc, GraphPad Software Inc.)用于进一步处理和分析。加入试剂至嗜中性粒细胞的顺序和孵 育时间可根据进行的测定法的类型改变。
[0185] C5a中和测定法 制备IOx 3倍连续稀释的C5aR拮抗剂，浓度范围为1000 Pg/ml至1. 37 Pg/ml。在室 温下将Fluo-4 AM负载的嗜中性粒细胞（I X IO6个，在0.5 ml细胞缓冲液中）与50 μL IOx C5aR拮抗剂溶液（在管中的最终C5aR拮抗剂浓度：100 - 0. 137 Pg/ml) -起孵育 10分钟。细胞加上C5aR拮抗剂通过FACS分析约60秒，以建立基线荧光。然后加入50 μL 10 nM C5a以得到终浓度约I ηΜ，并继续测量荧光另外的约60秒。如果C5aR拮抗剂阻断 C5a_诱导的Ca2+-释放，那么不存在荧光峰。如果C5aR拮抗剂不中和C5a，那么存在荧光峰。 最后，加入50 μL lPg/ml伊屋诺霉素至终浓度为0.1 Pg/ml，并继续测量荧光另外的约60 秒，以确保细胞仍有反应。
[0186] 实施例3 抗-C5aR在胶原诱导的关节炎（CIA)模型中的作用 小鼠 雄性DBA/1小鼠（10-11周龄）获自Taconic (Denmark)，使其休息一周，然后开始实 验。在标准条件下饲养小鼠（10只小鼠/笼），并使其接受标准饲料和水。
[0187] 用于诱导CIA的免疫 在第 0 天，用在完全弗氏佐剂（2 mg/ml, Arthrogen_CIA?Adjuvant，Chondrex, USA) 中1:1乳化的100 μL牛II型胶原（bCII, 2 mg/ml, Chondrex, USA)，在尾基部皮内 (i.d.)免疫小鼠。在第21天，用与不完全弗氏佐剂（Chondrex，USA)1:1乳化的100 μL bCII (I mg/ml, Chondrex, USA)，在尾基部给予（i.d.)小鼠加强免疫。在使用异氟烧/ 02/N20麻醉下免疫小鼠。
[0188] 关节炎的临床评分 从第21天至实验结束，每周5次对小鼠评分（除了周末的所有天数），根据以下评分要 点：〇点，如果无可见临床症状 1点/肿胀足趾（无论这是否包括一个或两个关节（_前爪的趾I)，对于包括肘节、跖 骨/掌骨为1点，对于包括腕关节、跗骨/腕骨为1点。在前爪可获得6的最大评分，和在 后爪可获得7的最大评分。根据Danish地区当局的人类终点的定义，在实验终止前处死获 得临床评分超过10的小鼠。
[0189] 抗-小鼠 C5aR mAb (m20/70) HC和LC的可变区源自大鼠抗-小鼠抗-C5aR mAb 20/70 (Shushakova等2002，Hycult biotech)。LC的恒定区是小鼠 kappa和HC的恒定区是设计在FC区中具有6个突变的小 鼠 IgG2a，产生 mIgG2a. 1。进行工程改造的突变 L234A、L235E、G237A (ADCC 失活）、D327Q、 A330S和P331S (⑶C失活）以减少ADCC或⑶C效应器机制。缺少与小鼠 Fe- γ受体I-IV 的结合通过表面等离子体共振分析来测定（数据未显示）。
[0190] 试验化合物和小鼠的治疗 当小鼠获得2-7的评分（在治疗开始时大多数小鼠具有2-4的评分）时，开始小鼠的 个体治疗性治疗。根据治疗，将小鼠随机化，使得对有资格开始治疗的第一小鼠给予化合物 1和对有资格开始治疗的第二小鼠给予化合物2,等等。使用该程序，在所有笼中提供所有 化合物，和在所有给药组中都提供早期和晚期关节炎发作小鼠。所有小鼠接受6个剂量，共 2周（治疗间隔为1-2天，因为在周末期间未给予治疗）。用以下化合物之一腹膜内（i. ρ.) 治疗小鼠： 20/70 抗-C5aR (小鼠 IgG2a. 1)，内毒素水平〈0· 10 EU/mg，0. 5 mg/ 小鼠 抗-TNP (小鼠 IgG2a. 1)抗体，内毒素水平0· 001EU/mg，0. 5 mg/小鼠 Etanercept? 10 mg/kg 抗-TNP (hzIgGl)抗体，内毒素水平〈0· 10EU/mg，10 mg/kg 血清样品 当治疗开始和结束时，通过异氟烷/02/N20麻醉小鼠和眼睛放血（约150 μL，最大为估 计总血体积的7. 5%)。采集血液至0.5 ml具有血块活化剂（BD Microtainer)的血清管中， 在室温下保持直至在4°C以15 000 G离心2分钟（在20分钟内）。将血清转移至I. 4 ml 微管中和在-80°C下储存直至使用标准ELISA测定法（R&D Systems)进一步分析基质金属 蛋白酶-3 (MMP3)水平。使用基质金属蛋白酶-3 (MMP-3) ELISA制造 R&D系统描述的测 定程序分析血清样品。血清样品需要用校准器稀释液以1:20稀释。其它炎症标志物使用 58-生物标志物多分析物概况（RodentMAP?, Myriad, RBM, Austin, USA)评价。
[0191] 用于组织学的爪制备物 在处死时，切下爪，在第三和第四趾之间至跟骨矢状分开以使固定和脱钙作用最优化。 在室温下将爪在4%多聚甲醛中固定48小时，并置于70%乙醇中。将爪在Immunocal中脱 钙7天，处理用于在ASP300组织处理器上石蜡包埋，并以切口表面向下包埋。将石蜡切片 以3 Mm切下并用标准HE染色进行染色，用于组织病理学评价。
[0192] 组织病理学评分系统 在后爪的远端指节间（DIP)、近端指节间（PIP)、跖骨和跗骨关节中的关节炎变化使用 评分系统评价（Sumariwalla等2004的改进），其中0=正常关节结构；1=轻度变化、滑膜 炎和血管翳前端几乎没有分离的软骨病灶侵蚀；2=中等变化，伴有软骨细胞失核，丢失大 面积的软骨，侵蚀血管翳前端具有一定的骨质侵蚀，和滑膜增生，具有侵润单核细胞和多形 核细胞；和3=重度骨质侵蚀和关节结构破坏。组织学评分指数计算为总累加评分/小鼠 除以评分的关节区域总数/小鼠（范围为6-8个关节区域/小鼠）。
[0193] 对于爪中更具体的破坏变化评分，在最坏影响的后爪的HE染色切片上对骨质侵 蚀和软骨降解分开评分。最坏影响的定义为具有最高组织学评分指数的爪（总累加评分/ 爪除以评分的关节区域总数）。如果两个爪具有相同的组织学评分，则选择右爪。骨质侵蚀 和软骨降解的严重性评分为0-3,和取平均值（累加评分除以评分的关节区域数）。
[0194] 统计学 试验化合物对临床评分的统计学显著影响通过使用双尾Mann-Whitney检验比较试 验化合物组与对照组来计算。对单个小鼠进行计算，在对临床评分的总实验时间期间使用 GraphPad Prism软件评价曲线下面积（AUC)。在实验结束前（6个治疗剂量后）处死的小 鼠以最后观察的评分包括在计算中。
[0195] 使用GraphPad Prism 5分析组织学数据，并使用不配对的带Welch校正的 Student t检验，评价治疗组的组织学评分指数的差异的统计学显著性。
[0196] 结果 在CIA模型中治疗性抗-C5aR治疗能够停止疾病发展。当比较抗-C5aR治疗与同种型 对照治疗时，观察到临床评分中的显著（P〈〇. 0001)差异。此外，系统骨破坏标志物MMP-3 水平的显著（P=〇. 0002)减少证实临床治疗效果。在依那西普治疗后存在可比较的临床抑 制评分和MMP3水平。
[0197] 对各小鼠的两个后爪进行关节炎变化的组织病理学终点评价。对各小鼠计算组织 学评分指数。与同种型对照治疗相比（n=15)，用抗-C5aR治疗（n=18)显著减少组织学评