分 指数（图3)。在处死时，在组织学评分指数（合并治疗组）和临床评分之间存在显著的相 关性（ρ〈0· 0001)。
[0198] 骨质侵蚀和软骨降解在各小鼠的最坏影响的后爪的HE染色切片上进行评价 (抗-C5aR n=18,抗-TNP n=15)。如图4所示，与用抗-TNP对照抗体（IgG2a. 1)治疗的小 鼠相比，用抗-C5aR治疗显著减少骨质侵蚀和软骨降解两者。
[0199] 实施例4 抗-C5aR治疗在小鼠单爪关节炎模型中的作用 在C57BL/6小鼠中诱导DTH-关节炎 DTH-关节炎通过在一个爪中用甲基化牛血清白蛋白（mBSA)引发经典DTH反应来诱 导，改变之处在于在免疫和攻击步骤之间给予Π 型胶原单克隆抗体混合物（Atkinson SA 等（2012) Arthritis Res Ther 14(3):R134)。简言之，雌性 C57BL/6 小鼠（8-10 周龄） 在第-7天用在完全弗氏佐剂（CFA) (Difco，Detroit, MI)中乳化的mBSA (Sigma, St. Louis，MO)在尾基部皮内免疫。四天后，它们静脉内接受在200 μL磷酸缓冲盐水（PBS) 中的1〇〇〇08(约5〇11^/1^)包含克隆厶2-1〇(18623)、？1〇-21(18623)、〇8-6(1862&)、 D1-2G (IgG2b)和 D2-112 (IgG2b)的 II 型胶原（CII)小鼠抗体 5-克隆混合物（Chondrex， Redmond, WA)。在第0天，用在20 μ I PBS中的200 Pg mBSA在右足垫中皮下攻击小鼠。 左足垫仅给予20 μ I PBS和作为对照。在足垫攻击后，小鼠在mBSA攻击的右足垫中发展 单爪关节炎。
[0200] 用抗_C5aR抗体治疗 为研究抗_C5aR治疗对关节炎评分的影响，对小鼠（n=10/组）用阻断抗-C5aR抗体 (m20/70 mIgG2a. 1，包括如上所述的6 Fc突变）或同种型对照抗体（抗-TNP - IgG2a. 1) 500 Pg i.p.治疗，每周两次，从关节炎诱导日（即第0天）起总共4个剂量。
[0201] 定量测量关节炎 作为主要功效读出，A爪肿胀的曲线下面积（AUC)从关节炎诱导后第0-11天计算，其 中爪肿胀的变化（A)计算为：关节炎诱导后的右爪厚度减去关节炎诱导前的右爪厚度。
[0202] 用于组织学的爪制备物 在关节炎诱导后第11天处死时，切下后爪，在第三和第四趾之间至跟骨矢状分开以使 固定和脱钙作用最优化。在室温下将爪在4%多聚甲醛中固定48小时和置于70%乙醇中。 将爪在Immunocal中脱钙7天，处理用于在ASP300组织处理器上石蜡包埋，并以切口表面 向下包埋。石蜡切片以3 切下。
[0203] 组织病理学变化评价 爪中的组织病理学变化在用常规苏木精和伊红（HE)概观染色进行染色的来自各爪的 三个切片上进行评价，分别地，破骨细胞酶酒石酸盐-抗性酸性磷酸酶（TRAP)染色用于骨 质侵蚀评价和Safranin 0用于证实软骨蛋白多糖损失。单独评价炎性细胞的关节外浸润 (以0-3刻度评价）和关节炎变化。关节炎变化在跖骨和跗骨关节上评价，其中滑膜炎（炎 性细胞的浸润和滑膜增生）、软骨降解和骨质侵蚀分别以0-3刻度评分。对于关节炎变化的 三个参数的每个，计算两个关节区域之间的平均值。在n=10抗-C5aR治疗小鼠和n=10对 照抗体治疗小鼠中进行组织学评价。
[0204] 统计学 对于组织学评分的统计学分析，使用非配对的带Welch校正的Student t检验。当p < 0.05时，组间差异认为是显著的，和显著性水平指定为*: p < 0.05，**: p < 0.01和 ***: p < 〇·001〇
[0205] 结果 与同种型对照抗体相比，自关节炎诱导日开始的抗_C5aR抗体治疗显示显著减少爪肿 胀（P〈0. 01，非配对的双侧student t-检验，数据未显示）。组织病理学评价显示抗-C5aR 治疗对关节炎变化（滑膜炎、软骨降解和骨质侵蚀）和对关节外浸润的高度显著影响（图 5)。这些发现一起显示，抗-C5aR治疗可预防关节中的关节炎变化，这证实抗-C5aR作为用 于治疗类风湿性关节炎（RA)和此外用于治疗骨损伤（包括骨质侵蚀和骨密度损失）的疗 法的合适性。
[0206] 尽管本发明的某些特征已在本文进行了说明和描述，但现在本领域普通技术人员 可想到许多改变、替换、变化和等同物。因此，应理解，随附权利要求意图涵盖所有这样的改 变和变化，其落入本发明的真实精神之内。
[0207] 实施例5 在胶原诱导的关节炎（CIA)模型中抗-C5aR的单剂量治疗 为研究抗_C5aR治疗的可能的快速起效影响，评价了单剂量治疗性治疗。如上进行处 理和分析小鼠（实施例3)。简言之，小鼠（n=22-26/组A-C)或（n=15-16/组D)在第0天经 免疫以诱导关节炎和在第21天加强免疫。当小鼠达到2-7的临床评分（对应于第1天的评 分），分别开始用抗_C5aR或抗-TNP (IgG2a. 1)的单剂量治疗（0. 5 mg/小鼠）。治疗后48 小时处死小鼠。使用58-生物标志物多分析物概况（RodentMAP?, Myriad, RBM, Austin, USA)在爪匀浆物中评价炎症标志物。通过在腿的毛皮线的右下方切下所有小鼠的后爪，制 备爪匀浆物。然后将爪在所有时间保持冷和在缓冲液中匀浆，缓冲液包含片Complete (Roche)、5 μL Triton X-100 (Sigma)和 500 μL FUT-175 (Calbiochem)，在 0.9 % 盐水中 (直至50 ml)。以10, 000G在4°C将匀浆物离心两次15分钟，并将上清液在-80°C储存直 至分析。
[0208] 结果 用抗-C5aR的单剂量治疗证实在24小时后疾病发展已经停止，这甚至在48小时后更 显著（图6A)。临床评分的AUC在给予单剂量抗-C5aR治疗的小鼠中显著更低（p=0. 0003) (图 6B)。
[0209] 在进一步的研究中，还在单剂量治疗后48小时评价组织病理学和嗜中性粒细胞 和巨噬细胞的浸润。如上述，观察到组织学评分指数的显著降低（P=〇. 0006)(图6C)。此 外，发现嗜中性粒细胞和巨噬细胞的浸润在48小时显著减少（未显示）。这些数据一起证 实，单剂量治疗的显著影响，以及对组织病理学评分的快速起效影响。
[0210] 用抗_C5aR的单剂量治疗产生炎性生物标志物的快速变化 在给予抗_C5aR后48小时，获自单剂量处理小鼠的爪匀浆物和血清样品中，研究一 组关于炎症的可溶分析物。发现与同种型（抗-TNP - IgG2a.l)治疗的小鼠相比，在接受 抗-C5aR治疗的小鼠中许多炎症标志物显著减少（表1)。
[0211] 除了爪中的局部反应之外，数个炎性分析物显示抗_C5aR治疗后在外周中显著减 少（表1)。
[0212] 基质金属蛋白酶MMP-3和MMP-9都在外周中显著（分别为ρ=0· 0028和ρ=0· 0006) 减少，对应于35-45%降低。此外，发现??ΜΡ-1的显著（p=0. 0015)减少，对应于47%降低（表 1)。这表明，单剂量抗_C5aR治疗对组织重塑和骨破坏的快速起效作用可在外周中检出。如 在爪匀浆物中所发现，在单剂量抗_C5aR治疗后，化学引诱物KC (CXCL1)、MCP-1 (CCL2)和 MCP-5 (CCLl2)也显著（分别为 ρ=0· 0〇78, ρ=0· 0〇28, ρ=0· 〇21)减少（2〇_5〇% 抑制）（表 1)〇
实施例6 在延迟型超敏性关节炎（DTHA)模型中抗-C5aR的单剂量治疗 为进一步研究C5aR拮抗剂的可能快速起效，在上述（实施例4) DTHA模型中在单剂量 研究中进一步评价了作用。
[0214] i. p给予用抗_mC5aR或抗-TNP (mIgG2a. 1)的单剂量治疗（0· 5 mg/小鼠）。治 疗开始后60小时终止实验。
[0215] 结果 在关节炎诱导时，单剂量的抗_C5aR当60小时后测量时导致爪和踝肿胀减少（图7A)。 组织病理学评价揭示，滑膜炎、软骨破坏和骨质侵蚀减弱，但炎性细胞的关节外浸润不受影 响（图7B)。总体的组织病理学评分也减少，如关节炎评分，其定义为属于关节炎表型的所 有个体评价参数的总和（图7C)。
[0216] 这些数据一起证实，单剂量的抗_C5aR具有显著减少DTHA中疾病发展和关节炎变 化的能力。
[0217] 为进一步研究受C5aR的阻断影响的途径和研究抗_C5aR是否导致炎性细胞活化 的减少，分析关节炎诱导后60小时获得的整爪匀浆物的大量细胞因子和趋化因子的蛋白 水平。
[0218] 简言之，爪匀浆物通过将爪在1. 25 ml的包含49. 995 ml 0. 9 %盐水、1片完全无 EDTA 蛋白酶抑制剂混合物（Roche, Switzerland)和 5 μL Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO)的冰冷匀浆缓冲液中匀浆产生。将爪使用T25 Ultraturrax?匀浆器（ΙΚΑ， Staufen, Germany)勾衆，接着以10, 000 g离心15分钟。倾出上清液，再次以10, 000 g 离心15分钟。分析得到的上清液。使用基于珠的Luminex? xMAP?技术与来自Millipore (Billerica, MA, USA)的Milliplex试剂盒，按照制造商的说明书，不经稀释地分析勾衆上 清液的炎性标志物水平。对于统计学分析，对于目标分析物，低于检测限的任何值设定为检 测限，和对于目标分析物，高于检测限的任何值设定为检测上限。在VCAM-UFGF (碱性） 和淋巴细胞趋化因子的情况下，使用58-生物标志物多分析物概况（RodentMAP?，Myriad RBM, Austin, USA)进行分析。
[0219] 在抗-C5aR_治疗的小鼠的爪中，炎性细胞因子IL-6显著降低，而未观察到IL-I β 或IL-10变化。此外，在抗-C5aR-治疗动物的爪中，化学引诱物CXCL1/KC、CXCL2/MIP-2、 CXCL5/LIX和淋巴细胞趋化因子显著减少，与G-CSF -样。最后，在抗-C5aR-治疗小鼠的 爪中，血管内皮生长因子（VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF)和血管细胞粘附分子1 (VCAM-I)也显著减少（表2)。结论是，单剂量的抗-C5aR能够介导局部炎性介导物的快速 变化，所述介导物为活化和浸润各种炎性细胞子集和内皮活化的标志物，并且是重要的。
表2.单剂量的抗-C5aR或IgG2a. 1后在爪组织中的炎症的蛋白生物标志物 使用多路分析，分析完整爪匀浆物上清液的众多炎性标志物的蛋白水平。对于详情，参 见材料和方法。结果表示为平均值土 SEM，和η = 10/组。当p彡0.05时，各组间的差异 认为是显著的，和显著水平指定为*: P彡0.05，**: ρ彡0.01和***: ρ彡0.001，使 用Student t检验。
【主权项】
1. C5aR拮抗剂，其用于治疗或预防具有关节炎的一个或多个症状的受试者的骨损伤， 其中所述C5aR拮抗剂是抗体。2. 权利要求1的C5aR拮抗剂，其中骨损伤包括骨质侵蚀和骨密度损失的一项或多项。3. 权利要求1或2的C5aR拮抗剂，其用于治疗或预防骨损伤和软骨降解。4. 权利要求2或3的C5aR拮抗剂，其中所述治疗用于减少骨损伤速度和/或软骨降解 速度。5. 权利要求2-4中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述治疗用于抑制或停止骨质侵蚀的进 展或用于增加骨密度。6. 前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述受试者患有骨质侵蚀或骨密度降 低。7. 前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述受试者患有关节炎，例如骨关节 炎、类风湿性关节炎、银肩病性关节炎或脓毒性关节炎。8. 前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述受试者是哺乳动物，例如人。9. 前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述治疗用于获得快速反应。10. 前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述C5aR拮抗剂抑制或减少C5a与 C5aR的结合。11. 前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述C5aR拮抗剂抑制或减少C5aR介 导的C5a的生物学作用，例如 a. C5a诱导的嗜中性粒细胞活化， b. C5a诱导的细胞迀移，和/或 c. C5a诱导的嗜中性粒细胞成熟。12. 前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂，其中所述C5aR拮抗剂是结合C5aR的第2 个环的抗体。13. 药物组合物，其包含前述权利要求中任一项的C5aR拮抗剂。14. 用于治疗或预防骨损伤的方法，包括给予有需要的个体治疗有效量的C5aR拮抗 剂。15. 权利要求14的方法，其中所述方法如权利要求1-11中任一项所述。
【专利摘要】C5a和C5aR刺激炎性反应，而C5aR拮抗剂可抵消该功能，其作为抗炎剂起作用。认为该功能性可用于治疗炎性疾病，包括自身免疫疾病。此外，已发现C5a和C5aR具有与骨体内稳态和重塑相关的功能，和C5aR拮抗剂可用于治疗骨损伤，例如骨质侵蚀和骨密度损失，和用于治疗骨损伤和软骨损伤。
【IPC分类】C07K16/28, A61K39/395
【公开号】CN105392803
【申请号】CN201480025887
【发明人】E.C.安德斯森, A.南森, P.A.厄谢尔
【申请人】诺和诺德股份有限公司
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2014年5月8日
【公告号】EP2994488A1, US20160060351, WO2014180961A1