;0. 05)。而40h (衰亡期）处所对应的黏附菌数显著 少于（P〈0. 05) 14h及32h处。以上结果说明，副干酪乳杆菌NCU622在稳定期时对Caco-2 细胞的黏附作用最强。可能是由于稳定期时，黏附素等物质的积累以及稳定的细胞结构都 利于黏附作用的发生。
[0068] (7)副干酪乳杆菌NCU622对Caco-2细胞的黏附性能
[0069] 副干酪乳杆菌NCU622在MRS液体培养基中培养14h后，制备浓度为I X IO8的菌 悬液，将其与Caco-2细胞共培养2h，计算黏附数并进行黏附观察。取黏附完毕的培养板，除 去各孔中培养液，用无菌PBS缓冲液洗涤5遍后晾干，进行革兰氏染色，在显微镜下观察菌 体对Caco-2细胞的黏附情况。
[0070] 副干酪乳杆菌NCU622对Caco-2细胞的黏附菌数为（21. 19±0. 94) CFU/Caco-2细 胞，黏附情况如附图3所示。
[0071] 实施例5:抑菌性能试验。
[0072] (1)抑菌活性测定。
[0073] 选用牛津杯法对副干酪乳杆菌NCU622的发酵液、无菌发酵滤液及菌体进行抑菌 活性测定，根据抑菌圈直径大小来评价抑菌效果。试验所选用的指示菌如下：单增李斯特 54001，阪崎肠杆菌CMCC45401，金黄色葡萄球菌26003,沙门氏菌CMCC50041，宋内志贺氏菌 ATCC29930,蜡样芽胞杆菌D1，大肠埃希氏菌CMCC44496,铜绿假单胞杆菌CMCC10104。
[0074] 副干酪乳杆菌NCU622的发酵菌液及无菌发酵滤液对所有指示菌包括革兰氏阳性 菌及革兰氏阴性菌均有较好的抑菌作用，而菌体对所有指示菌均无抑菌作用。MRS液体培养 基没有抑菌作用（结果未显示）。发酵菌液比无菌发酵滤液对所有指示菌有更强的抑菌效 果。
[0075] (2)无菌发酵滤液的抑菌作用。
[0076] 以大肠埃希氏菌CMCC44496,金黄色葡萄球菌26003,单增李斯特54001，宋内志贺 氏菌ATCC29930为指示菌，用无菌发酵滤液进行培养。为了测定发酵过程中产生的乳酸及 MRS培养基pH的改变对致病菌活性的影响，用无菌发酵滤液（pH6. 2)、MRS液体培养基（补 充与无菌发酵滤液中相同量的乳酸）、MRS液体培养基来培养上述指示菌。利用高效液相色 谱来测定无菌发酵滤液中乳酸的含量。指示菌过夜培养后以体积分数为1%的接种量接种 到上述四种培养基中，37°C恒温培养，分别于0、l、2、3、4h取样，采用胰蛋白胨大豆琼脂培 养基进行平板计数。
[0077] 副干酪乳杆菌NCU622在MRS液体培养基中培养24h后，MRS液体培养基的pH值由 6. 2降低至3. 62,乳酸的浓度达到157. 34mM。为了考察发酵过程中产生的乳酸及MRS液体 培养基pH的变化对致病菌的活性是否有影响，用无菌发酵滤液（pH6. 2)及MRS液体培养基 (补充有157. 34mM的乳酸）分别培养致病菌。在无菌发酵滤液中作用Ih后，大肠埃希氏 菌CMCC44496,单增李斯特菌54001和宋内志贺氏菌ATCC29930的活菌数降低了 I. 7-1. 91g CFU/mL，金黄色葡萄球菌26003丧失活性。当无菌发酵滤液的pH值调整至6. 2时，相同时 间点致病菌的活菌数与MRS液体培养基中相比无显著性差异（P>0. 05)，说明无菌发酵滤液 的抑菌活性与其pH值有关。补充有157. 34mM乳酸的MRS液体培养基中致病菌的活菌数较 MRS液体培养基中显著降低，说明副干酪乳杆菌NCU622发酵过程中产生的乳酸是产生抑菌 活性的因素之一。补充有157. 34mM乳酸的MRS液体培养基比无菌发酵滤液对四株致病菌有 更强的抑制作用，可能是因为MRS液体培养基中非解离乳酸的量比无菌发酵滤液中多（有 机酸如乳酸的抑菌作用主要取决于它们的非解离形式）。
[0078] (3)热处理对无菌发酵滤液抑菌活性的影响。
[0079] 样品分别在60、80和100°C水浴中处理20min，121°C高压蒸汽处理20min，设置空 白对照。以大肠埃希氏菌CMCC44496,宋内志贺氏菌ATCC29930,金黄色葡萄球菌26003,单 增李斯特54001为指示菌，副干酪乳杆菌NCU622为供试菌，采用牛津杯法进行抑菌活性测 定。
[0080] 无菌发酵滤液经过4种温度条件处理后，其对致病菌的抑菌活性与对照组相比无 显著性差异（P>〇. 05)，说明副干酪乳杆菌NCU622产生的抑菌物质对热不敏感。
[0081 ] (4)蛋白酶及过氧化氢酶预处理对无菌发酵滤液抑菌活性的影响。
[0082] 分别用浓度为lmg/mL的木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶K、胃蛋白酶、过氧化氢酶 在其最适PH条件下水浴（37°C )处理无菌发酵滤液lh，处理后将样品pH调整至初始值。设 不加酶的空白对照，相同方法处理。以大肠埃希氏菌CMCC44496,宋内志贺氏菌ATCC29930， 金黄色葡萄球菌26003,单增李斯特54001，为指示菌，副干酪乳杆菌NCU622为供试菌，采用 牛津杯法进行抑菌活性测定。
[0083] 无菌发酵滤液经胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K及木瓜蛋白酶分别处理后，抑菌效 果与对空白照组相比无显著变化（P>〇. 05)，说明该研究中抑菌物质对蛋白酶不敏感。经过 氧化氢酶处理后，无菌发酵滤液的抑菌活性与空白对照组相比无显著变化（P>〇. 05)，说明 副干酪乳杆菌NCU622产生的抑菌物质中可能无过氧化氢，或者其所含的过氧化氢浓度不 足以产生抑菌效果，排除了过氧化氢的干扰。
[0084] 结论：副干酪乳杆菌NCU622的发酵液及无菌发酵滤液的抑菌谱广泛，对革兰氏阳 性菌及革兰氏阴性菌均具有较好的抑菌活性。发酵过程中乳酸的产生及发酵液pH的降低 是主要的抑菌因素。抑菌物质具有热稳定性，没有蛋白质性质，且排除过氧化氢的作用。
[0085] 实施例6 :抗氧化活性。
[0086] (1)样品处理。
[0087] 活菌体：将副干酪乳杆菌NCU622接种于MRS液体培养基中，37°C培养14h，离心 (4500r/min，IOmin)，收集菌体，用PBS缓冲液洗涤3遍后重悬。
[0088] 无细胞提取液：收集离心所得菌体，用去离子水洗涤3遍后重悬，经65°C处理 40min后，超声波破碎（400W，破碎5s，间隔5s，粉碎8min)，细胞碎片经离心后除去，所得上 清液即为无细胞提取液。
[0089] 无菌发酵滤液：菌体离心后，取上清液，经0. 22 μ m微孔滤膜过滤，收集滤液即为 供试菌的无菌发酵滤液。
[0090] ⑵DPPH自由基清除率的测定。
[0091] 样品组：取 0、0· 2、0· 4、0· 6、0· 8、L 0、L 5、2. OmL样品分别加入到 2mL DPPH 乙醇溶 液（0. lmmol/L)中，样品体积不足2mL者用pH7. 4的PBS溶液补足；对照组：在2mL乙醇溶 液中加入2mL DPPH乙醇溶液。空白组：2mL乙醇溶液加不同浓度样品液。将以上反应体系 置于黑暗中，室温下静置反应30min。加入等体积的三氯乙酸进行抽提，离心（4500r/min， IOmin)后收集上清，于517nm处测定吸光值。DPPH自由基清除率的计算方法如下式：
[0092] DPPH自由基清除率（％) = [1_(A样品-A空白）/A对照]X 100
[0093] DPPH自由基是含有单个的稳定自由基，其乙醇溶液在517nm处有较强吸收，对该 自由基有清除能力的物质可降低其