蛋白胨30份，葡萄糖20份，酵母粉1份，氯化钠5份，Na2HP042. 5份，ΚΗ2Ρ040· 83 份，MgS040. 1份，枸橼酸钠0. 5份，尿素6份，复合维生素Β0. 0003份。
[0129] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0130] 蛋白胨10份，葡萄糖10份，酵母粉1份，氯化钠6份，Na2HP04l份，ΚΗ2Ρ040 . 4份， MgS040. 1份，枸橼酸钠0. 1份，尿素2份，复合维生素B0. 0002份。
[0131] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0132] 蛋白胨20份，葡萄糖20份，酵母粉2份，氯化钠6份，Na2HP04l份，ΚΗ2Ρ040 . 4份， MgS040 . 3份，枸橼酸钠0. 1份，尿素4份，复合维生素B0. 0003份。
[0133] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0134] 蛋白胨30份，葡萄糖30份，酵母粉3份，氯化钠6份，Na2HP04l份，ΚΗ2Ρ040 . 4份， MgS040 . 5份，枸橼酸钠0. 1份，尿素6份，复合维生素B0. 0004份。
[0135] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0136] 蛋白胨10份，葡萄糖30份，酵母粉1份，氯化钠4份，Na2HP045份，KH2P041. 6份， MgS040 . 5份，枸橼酸钠0. 3份，尿素4份，复合维生素B0. 0003份。
[0137] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0138] 蛋白胨20份，葡萄糖10份，酵母粉2份，氯化钠4份，Na2HP045份，KH2P041. 6份， MgS040. 1份，枸橼酸钠0. 3份，尿素6份，复合维生素B0. 0004份。
[0139] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0140] 蛋白胨30份，葡萄糖10份，酵母粉1份，氯化钠4份，Na2HP045份，KH2P041. 6份， MgS040 . 3份，枸橼酸钠0. 5份，尿素4份，复合维生素B0. 0004份。
[0141] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0142] 蛋白胨10份，葡萄糖20份，酵母粉2份，氯化钠5份，Na2HP042. 5份，ΚΗ2Ρ040· 83 份，MgS040 . 5份，枸橼酸钠0. 5份，尿素6份，复合维生素Β0. 0002份。
[0143] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0144] 蛋白胨20份，葡萄糖20份，酵母粉1份，氯化钠5份，Na2HP042. 5份，ΚΗ2Ρ040· 83 份，MgS040 . 5份，枸橼酸钠0. 1份，尿素2份，复合维生素Β0. 0004份。
[0145] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0146] 蛋白胨30份，葡萄糖30份，酵母粉2份，氯化钠5份，Na2HP042. 5份，ΚΗ2Ρ040 . 83 份，MgS040. 1份，枸橼酸钠0. 1份，尿素4份，复合维生素B0. 0002份。
[0147] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0148] 蛋白胨10份，葡萄糖10份，酵母粉3份，氯化钠6份，Na2HP04l份，ΚΗ2Ρ040 . 4份， MgS040 . 3份，枸橼酸钠0. 1份，尿素6份，复合维生素B0. 0003份。
[0149] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0150] 蛋白胨30份，葡萄糖10份，酵母粉2份，氯化钠6份，Na2HP04l份，ΚΗ2Ρ040 . 4份， MgS040 . 5份，枸橼酸钠0. 3份，尿素2份，复合维生素B0. 0003份。
[0151] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0152] 蛋白胨10份，葡萄糖20份，酵母粉3份，氯化钠6份，Na2HP04l份，ΚΗ2Ρ040 . 4份， MgS040. 1份，枸橼酸钠0. 3份，尿素4份，复合维生素B0. 0004份。
[0153] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0154] 蛋白胨20份，葡萄糖30份，酵母粉1份，氯化钠4份，Na2HP045份，KH2P041. 6份， MgS040 . 3份，枸橼酸钠0. 3份，尿素6份，复合维生素B0. 0002份。
[0155] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0156] 蛋白胨10份，葡萄糖30份，酵母粉2份，氯化钠4份，Na2HP045份，KH2P041. 6份， MgS040 . 3份，枸橼酸钠0. 5份，尿素2份，复合维生素B0. 0004份。
[0157] 在本发明提供的另一些实施例中，以重量份计，培养基中各组分用量为：
[0158] 蛋白胨20份，葡萄糖10份，酵母粉3份，氯化钠4份，Na2HP045份，KH2P041. 6份， MgS040 . 5份，枸橼酸钠0. 5份，尿素4份，复合维生素B0. 0002份。
[0159] 作为优选，复合维生素B包括生物素、叶酸、核黄素、肌醇、盐酸吡哆醇或尼古丁酸 中的一种或两种以上的混合物。
[0160] 作为优选，生物素、叶酸、核黄素、肌醇、盐酸吡哆醇与尼古丁酸的质量比为（10~ 20) : (1 ~5) : (150 ~200) : (1000 ~1200) : (400 ~500) : (400 ~500)。
[0161] 作为优选，生物素、叶酸、核黄素、肌醇、盐酸吡哆醇与尼古丁酸的质量比为20 :2 : 200 :1000 :400 :400〇
[0162] 作为优选，培养基的pH值为7. 0~7. 2。
[0163] 绿脓杆菌属于好氧微生物，发酵罐生产中由于养分及氧气充足可使菌数快速上 升，菌体对糖的分解产物如乙醇、甲醇、乙酸、芳香族化合物等对绿脓杆菌生长产生抑制作 用，根据绿脓杆菌可利用葡萄糖和尿素的生化特性，采用单一补料分批发酵的方式在培养 6~7h后补加葡萄糖作为碳源和尿素作为氮源，使发酵系统中保持合适的营养物浓度，保 持微生物生长的适宜环境条件以达到高菌体浓度。作为优选，一级发酵培养至6~7h补加 葡萄糖和尿素，二级发酵培养至6~7h补加葡萄糖和尿素。
[0164] 在本发明提供的一些实施例中，葡萄糖在发酵培养基中的浓度为10g/L，尿素在发 酵培养基中的浓度为2g/L。
[0165] 作为优选，一级发酵中接种与发酵培养之间还包括加入消泡剂的步骤，二级发酵 中接种与发酵培养之间还包括加入消泡剂的步骤。
[0166] 在本发明提供的一些实施例中，发酵种子液制备中二级种子的接种体积百分含量 为2%，一级发酵中发酵种子液的接种体积百分含量为3%，二级发酵中一级发酵液的接种 体积百分含量为4%。
[0167] 本发明提供了一种绿脓杆菌发酵培养基及其发酵培养方法、疫苗制备方法。该发 酵培养基包括蛋白胨、葡萄糖、酵母粉、氯化钠、Na2HP04、KH2P04、MgS04、枸橼酸钠、尿素和复 合维生素B。本发明至少具有如下优势之一：
[0168] 1、本发明发酵培养基适合绿脓杆菌高密度发酵生长，可大大提供绿脓杆菌的活菌 数；与原有传统培养基相比，本发明提供的改良培养基明显将对数生长期由4~8h延长至 4~10h，菌数由140~159亿提高至240~250亿，pH值稳定在7.0,大大提高了绿脓杆菌 的产量；
[0169] 2、本发明研究发现在发酵培养的6~7h补充葡萄糖和尿素可提高绿脓杆菌的活 菌数，采用本发明发酵培养基对绿脓杆菌进行发酵培养时，不补料的情况下对数生长期为 4~9h，稳定期为9~12h，菌数稳定在196~200亿；补料情况下菌体的对数生长期为4~ l〇h，稳定期为10~12h，菌数稳定在240~250亿，pH值在培养的1~12h内均稳定在7. 0 左右。
[0170] 3、本发明通过100L、500L、1000L发酵罐逐级发酵方法的建立，确定了种子液的菌 数、接种比例，种子液保存时间，传代次数，发酵收获时间，改良后的培养基及发酵罐的生产 工艺可使菌数稳定到250亿CFU，比转瓶培养法菌数提高了 5~10倍，可大批量生产。
【附图说明】
[0171] 图1示实施例1改良培养基与对比例1传统培养基对发酵过程中pH值的影响；
[0172] 图2示实施例1、实施例19与对比例1发酵工艺绿脓杆菌的生长曲线对比。
【具体实施方式】
[0173] 本发明公开了一种绿脓杆菌发酵培养基及其发酵培养方法、疫苗制备方法，本领 域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替 换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方 法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和 范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0174] 本发明提供的绿脓杆菌发酵培养基及其发酵培养方法、疫苗制备方法中所用试 剂、培养基成分均可由市场购得。
[0175] 复合维生素B液组成：生物素20mg/L，叶酸2mg/L，核黄素200mg/L，肌醇lOOOmg/ L，盐酸吡咳醇400mg/L，尼古丁酸400mg/L。116°C20min单独高压灭菌。
[0176] PYG培养基成分：蛋白胨20g/L，葡萄糖10g/L，酵母粉3g/L，氯化钠5g/L，调节pH
[0177] 下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0178] 实施例1~3发酵培养基及发酵培养方法
[0179] 本实施例中的发酵培养基成分如下表所示：
[0180] 表1发酵培养基成分
[0183] 发酵生产工艺流程如下：
[0184] 一级种子制备：取DL15株和JL08株冻干菌种各1支启封，用灭菌生理盐水稀释， 分别接种PYG琼脂培养基，37°C培养24小时，挑选5个以上典型菌落混合于少量PYG液体 培养基中，再接种PYG琼脂斜面培养基若干，37°C培养24小时，作为一级种子。2~8°C保 存，使用期不超过15日，传代不超过5代。
[0185] 二级种子制备：取一级种子接种若干支5mLPYG液体培养基中，37°C振摇12小时， 再按3%比例接种较大量的PYG液体培养基中，37°C振摇12小时，经纯粹检验合格后，作为 二级种子，置2~8°C保存，保存应不超过4日。
[0186] 发酵种子液的制备：将二级种子液按本实施例发酵培养基体积的2%比例接种于 装有50~60L培养基的100L发酵罐中，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数如下：罐 温37°C，搅拌速度120r/min，进气流量70L/min，罐压70Kpa，7h收获，作为发酵种子。保存 不超过4天，传代不超过3代。
[0187] 发酵菌液的制备：
[0188] -级发酵：将发酵种子液按本实施例发酵培养基体积的3%比例接种于装有 250~300L培养基的500L发酵罐，加入消泡剂泡敌，培养6h后补料加入100g/L的葡萄糖 和60g/L的尿素至终浓度分别为10g/L和2g/L作为补充碳源，发酵期间主要控制参数如 下：罐温37°C，搅拌速度110r/min，进气流量80L/min，罐压70Kpa，12h收获，经纯粹检验合 格后，即为半成品菌液，菌数稳定在250亿CFU/mL。
[0189] 二级发酵：将发酵的二级种子液按本实施例发酵培养基体积的4%比例接种于装 有500L~600L培养基的1000L发酵罐，培养6h后补料加入100g/L的葡萄糖和60g/L的尿 素至终浓度分别为l〇g/L和2g/L作为补充碳源，加入消泡剂泡敌，发酵期间主要控制参数 如下：罐温37°C，搅拌速度100r/min，进气流量90L/min，罐压70Kpa，12h收获，经纯粹检验 合格后，即为发酵菌液，检测活菌数及pH值，重复3次，并对结果进行显著性差异分析。菌 数及pH值见表2。
[0190] 表2发酵培养基的培养菌数及对pH影响的比较（发酵12h)
[0191]
[0192] 实施例4~6发酵培养基及发酵培养方法
[0193] 本实施例中的发酵培养基成分如下表所不：
[0194] 表3发酵培养基成分
[0195]
[0196]